1、问川剧甲东!行标;SN/3767.23-2014 出晶中转温扩增(LAM)检测23部分:71牺KM介avh可BHqc 1=11=1 1飞Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export-Part 23: Rice 区MD2014皿01-13发布2014-08-01实施中华人民共和国发布国家庭竞量监督检拴捡痊总局SN/T 3767.23-2014 目。吕SN/T 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法
2、共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米面一11品系;第4部分:玉米Bt176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米MON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704一12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;
3、第19部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻KF6品系;第22部分:水稻KF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28部分:小麦B73-6-1品系;第29部分:甜菜H7-1品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SN/T3767的第23部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部
4、分起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部本主要起草人:广E彼珊、王小玉、刘李登、冯家望、李志勇、曾静、薛峰、胡松楠、游淑珠、陈敬、常彦磊。I SN/3767.23一20141 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第23部分:水稻KMD品系SN/T 3767的本部分规定了7J1磊及其加工产品中转基在i水韬KMD品系特异性的环介导等温扩增CLAMP)初筛检测方法。本部分适用于水稻及其加工产品中转基因水摇KMD品系特异性的定性检测。本
5、方法的定性检测低限为0.5%C质量分数)0二/ / 2 规范性引用文件/ 下列文件对于本文件的应用是海不可少的。此茹苦一日期I切I周文1牛，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新服本(包捂所有的修改单)适用亏本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2 转基因产品才面前去岳重技末要茶一气GB/T 19495.3 转基因产品检测GB/T 19495.7 转基因产品检测/抽样和制样方法SN/T 37川2014出口食品中转基因成分环分导等强扩增(主AMP)检测方法选方法3 防污染措施飞!环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T194，9
6、5.2的规定。4 抽样与制样/ 按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理第2部分:筛根据转基因水稻KMD品系外源基因和水稻边界序列(参见附录A)设计特异性内引物和外引物各SN/T 3767.23-2014 一对，特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核昔酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链t互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA泪合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生
7、副产物(焦磷酸镜)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应?昆合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因产品。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green 1是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色;当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。
8、6.2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:63.0oC士0.5oC和80.0oC :1: 0.5 oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL6.2.4 移液器:量程0.5L10L;量程10L100L;量程100Ll000Lo 6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs 溶液:每种核仔酸浓度10mmol/Lo 6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/11L。6.3.4 10 Thermo
9、lPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HC1(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/L 氧化饵、20mmol/L硫酸镜、1% Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:150 mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L。6.3.7 显色液:SYBR Green 1荧光染料，1000。6.3.8 引物:根据转基因水稻KMD品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:278 bp 夕|、引物1(F3 , 5 -3 ) : GG AACAACACTCAACCCT A TC 夕卡引物2(B3,
10、 5 -3) : GCCCATCTCGGGATAT ATTGT 内引物l(FIP，5人3) : GCCCCAGCAGGCG AAAA TCA TTTTGCCG A TTTCGG AACCA 内引物2(BIP , 5 -3 ) : AGGCGG TG AAGGGCAA TCAAA T AACACA TTGCGG ACG T 6.4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1. 1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。2 SN/T 3767.23一20146.4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替
11、DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一-LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4 .2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从样品中提取的DNA，可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照本SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4 .3 水稻KMD品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混
12、合进入反应液中。表1水稻KMD晶系LAMP反应体系组t分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2. 5 1 外引物1(F3)10mol/L O. 5 0.2 vmol/L 外引物2(B3)10mol/L O. 5 0.2 vmol/L 内引物l(FIP)40mol/L 1. 0 1. 6 vmol/L 内引物2(BIP)40mol/L 1. 0 1.6mol/L dNTPs 10 mmol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 5 1 mol/L 硫酸续150 mmol/L 1 6 mmol/L Bst DNA聚合酶8 UIL 1 0.32 U/vL
13、 DNA模板100 nglvL 2 8 nglL 水补足至25.06.4 .4 LAMP反应参数63.0 C士0.5C恒温扩增90min ,80.0 C士0.5C 5 min使酶灭活，反应结束。6.4 .5 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈隆色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈橙色。3 SN/T 3767.23-2014 6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色
14、。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品转基因水稻KMD品系初筛阳性，应通过对外引物PCR扩增产物的序列测定进行确证(见附录A)。8 结果表述8.1 检测结果为阴性，8.2 断和表述。4 SN/T 3767.23-2014 附录A(资料性附录)转基因水稻KMD品系基因序列A.1 转基因水稻KMD品系外源基因和水韬边界序列(Accessionno.EU980363.1) 2 GGAACAACACTCAACCCTATCTCGG
15、GCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGAT 61 TTCGGAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTG 121 CTGCAACTCTCTCAGGdCCAGGTG函函再函马TGTTGCCCGTCTCACTGGTG181 AAAAGAAAAACCACCCCAGTA口AAAAACGTCCGCAA7GTG甘A.2引二F3: GGAACAACACTCAACCC主ATCB3: GCCCA TCTCGGGA T A llATTGT二。、jF1c d 飞、叭二F2川;即:GCCCCAGCAGGCGA坦坦4坦坦坦些均主CCA如BIP , 5 立ON|的N.hSHZ的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第23部分:水稻KMD品系SN/T 3767.23-2014 兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029) 北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533网址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷民印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷1/16 2014年12月第一版印数1-1300 开本880X 1230 定价16.00元当C书号:155066 2-27477 3767.23-2014
