1、共和境飞5 SN/3767.27-2014 晶中转温扩增(7部分:71去喝，V.-恙。-,-f噩于同主主肌Nlcnfl剧5com也i.Z4:x;，82315在是2一音AE家庭竞量监发布SNj3767.27-2014 目。唰品嗣嗣严习SNjT 3767(出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法共分为30部分:第1部分:通用要求和定义;第2部分:筛选方法;第3部分:玉米Bt-ll品系;第4部分:玉米面176品系;第5部分:玉米GA21品系;第6部分:玉米MIR162品系;第7部分:玉米MIR604品系;第8部分:玉米MON810品系;第9部分:玉米MON863品系;第10部分:玉米M
2、ON88017品系;第11部分:玉米MON89034品系;第12部分:玉米T-25品系;第13部分:玉米3272品系;第14部分:玉米59122品系;第15部分:大豆A2704-12品系;第16部分:大豆A5547-127品系;第17部分:大豆DP356043品系;第18部分:大豆GTS40-3-2品系;第四部分:大豆MON89788品系;第20部分:水稻Bt-63品系;第21部分:水稻lKF6品系;第22部分:水稻iKF8品系;第23部分:水稻KMD品系;第24部分:水稻LLRICE62品系;第25部分:水稻M12品系;第26部分:水稻T1C-19品系;第27部分:水稻T2A-1品系;第28
3、部分:小麦B73-6一l品系;第29部分:甜菜H7l品系;第30部分:油菜RT-73品系。本部分为SNjT3767的第27部分。本部分按照GBjT1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人:黄文胜、邓婷婷、吴亚君、陈颖、李新实、韩建勋、傅凯、赵贵明、王斌、陈双雅、李志勇。I 1 范围出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第27部分:水稻2A
4、-l品系SN/T 3767本部分规定了初筛检测方法。2 规范性引用文件GB/T 6682 GB/T 19495.2 GB/T 19495.3 GB/T 19495.7 转基因产品SN/T 3767.2-2014 出口选方法3 防污染措胞环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照GB/T19495.7的规定执行。5 核酸提取纯化按照GB/T19495.3的规定执行。6 LAMP检船方法6.1 原理6. 1. 1 一般原理SN/3767.272014 的环介导等温扩增CLAMP)根据转基因水稻T2A-1品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各x;j(特异性目标SN/3767.27-2014
5、 序列和寻|物碱基序列参见附录A)，特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸兰磷酸、寡核背酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异目标序列启动互补链合戚，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNAt昆合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物(焦磷酸镇)形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。6. 1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加入预先混合的钙黄绿素和锚离子，未发生反应时锯离子与钙黄绿素结合，钙黄绿素的荧光被碎灭，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程
6、中产生的焦磷酸根离子可与锚离子结合，形成不可逆的沉淀物，将锚离子从钙黄绿素七释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镇离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光，颜色也由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2.1 )国纯水发生器。6.2.2 水浴锅或加热模板:65.0 oC =1: 0.5 oC和80.00C土0.5oC。6.2.3 离心管:0.1mL、1.5mL。6.2.4 移液器:革命程0.5L10fJ.L;量程10L100L;量程100/-lL 1 000L。6.2.5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯
7、或生化试剂。6.3.1 实验用水:应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 dNTPs 溶液:每种核背酸浓度10mmol/L。6.3.3 Bst DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/-lL。6.3.4 10 ThcrmolPol缓冲液:含200mmol/L Tris-HCl(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸镜、100mmol/L 氧化何、20mmol/L硫酸镜、1%Triton X-100。6.3.5 硫酸镜溶液:50mmol/L。6.3.6 甜菜碱:5mol/L 6.3.7 显色液:钙黄绿素(Calcein)。6.3.8 引物:根据转基因水
8、稻T2A-1品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物l和内引物2，环引物1和环引物20夕卡引物1(F3 , 5 -3) : GCGGGATATCATTTGCCTGTAAC 夕卡引物2(B3 , 5 -3 ) : CCG A TGAGGCT ACCCACCTTCTT 内引物l(FIP，5一3): TGTAGGCGTCGCAGATGGTGATCCCCACCCAAAGGTAAGGCTATGAA 内引物2(BIP，5-3): AATGGATGGAGTGGAAGCGCACGCTCGACACAGTGCCGACCACT 环引物1(FLP，5-3): GCCGCTGTTCA
9、GCACGTTGT 环引物2(BLP，5-3):GGACCACAGCCTCTACGTCG 6.4 实验步骤6.4 .1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:SN/T 3767.27-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4 .1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空白对照:一一提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品); 一一LAMP反应的空白对照(以DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行内源基因检测，结果阳性则表明从
10、样品中提取的DNA可以进行外源基因检测;否则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.2-2014的规定进行。6.4 .3 水稻T2A-1品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表l。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。表1水稻T2A】1晶系LAMP反应体系组分工作液浓度加样量/L反应体系终浓度ThermolPol缓冲液10 2.5 1 外引物lCF3)5mol/L 1. 0 0.2mol/L 外引物2CB3)5mol/L 1. 0 0
11、.2mol/L 内引物lCFIP)40 f1mol/L 1. 0 1. 6 f1 mol/L 内引物2CBIP) 40mol/L 1. 0 1.6mol/L 环引物1CFLP)10mol/L 1. 0 0.4 f1mo l/L 环引物2CBLP)10mol/L 1. 0 0.4 f1 mol/L dNTPs 10mol/L 4 1. 6 mmol/L 甜菜碱5 mol/L 4 0.8 mmol/L 硫酸筷100 mmol/L 6 mmol/L 0.5 (包括缓冲液中所含硫酸筷)钙黄绿素CCalcein)2.5 mmol/L 1 0.1 mmol/L Bsl DNA聚合酶8 U/f1 L 1 0
12、.32 U/L DNA模板100 ng/f1L 2 8 ng/L 补足至25.06.4.4 LAMP反应参数65.0 oC :!:0.5 oC恒温扩增70mi口，80.0oC :!:0.5 oC 5 min使酶灭活，反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后，在黑色背景下立即进行颜色观察。3 SN/T 3767.27一20146.5 质量控制6.5.1 基本原则:实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验。6.5.2 空白对照:反应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反应管中液体呈桂色。6.5.4 阳性对照:反应管中液体呈绿色。7
13、结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管转基因水稻KF8品系初筛阳性，8 结果表述8.1 检测结果为阴性，结果正常，可判断该样品检测结验对照结果正常，可判断该样品测定等相关方法进行确证。出转基因水宿T2A叩l品系号。品系如第113姓，应按照确证实验情况进行结果判断和表述(见附录A)。4 SN/T 3767.27一2014附录A(资料性附录)转基因水稻T2A-1品系基因序列A.1 转基因水稻T2A-1品系外源基因和水韬边界序列GCGGGATATCATTTGCCTGTAACCGGTTTCCTJVGCGAAAACCCCCCCACCCAAAGGT :1:
14、古川叫:2212jj;j BI二GG:;:r:21:立:fAAI 飞飞飞5 立ON-AN.khk川的HZ的中华人民共和罔l:H入境检验检疫行业标准出口食品中转基因成分环介导等温扩增CLAMP)检测方法第27部分:水稻T2A-l品系SN/T 3767.27-2014 去中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(00029) 北京市西城区三旦河北街16号(100045) 总编室，(010)68533533网址www.spc.口中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷-x. 印张0.75字数10千字2014年12月第一次印刷开本880X12301/16 2014年12月第一版印数1-1300 定价16.00元书号:155066 2-27482 SN/T 3767.27-2014
