1、ICS 11.220 B41 DB33 浙江省 地方标准 DB 33/T 822 2011 高致病性猪蓝耳病 RT-PCR 检测技术 RT-PCR detection technique for highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2011 - 03 - 25 发布 2011 - 04 - 25 实施 浙江省质量技术监督局 发布 DB33/T 822 2011 I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写 和 GB T 20001.4-20
2、01 标准编写规则 第 4部分：化学分析方法 的规定编写 。 本标准由 浙江省 农业厅 提出。 本标准由 浙江省 畜牧兽医标准化技术委员会 归 口。 本标准起草单位： 浙江省 动物疫病预防控制中心 、中国动物卫生与流行病学中心 。 本标准起草人： 徐辉、李晓成、吴发兴、赵灵燕、张燕霞、倪柏锋、周彩琴、 陆国林、 吴赟竑、陈星宇、王燕萍 、周蕾 。 DB33/T 822 2011 1 高致病性猪蓝耳病 RT-PCR 检测技术 1 范围 本标准规定了 高致病性猪蓝 耳病病毒 RT-PCR检测技术 。 本标准适用于 猪只感染高致病性和美洲型经典猪蓝耳病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本
3、文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 高致病性猪蓝耳病 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome 简称 HP-PRRS， 是由猪繁殖与呼吸综合症（ Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种猪的急性高致死
4、性疫病。 临床上 表现为 体温明显升高 ，可达 41以上 ， 眼结膜炎、眼睑水肿 ， 咳嗽、气喘等呼吸道症状；部分猪出现后躯无力、不能站立或共济失调等神经症状。 PRRSV是套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员。 3.2 逆转录 -聚合酶链反应 reversi transcriptase polymerase chain reaction ， RT-PCR 将 RNA的反转录（ RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从 RNA合成 cDNA，再以 cDNA为模板，扩增合成目的片段。 4 缩略语 下列缩略语适用于本标准 。 bp base pair
5、，碱基对。 DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTPs Deoxyribonucleoside Triphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸。 IFA immunofluorescence assay，免疫荧 光测定。 PCR polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。 RT-PCR reverse transcription PCR，反转录 PCR。 Taq酶 Taq DNA Polymerase， Taq DNA聚合酶。 DB33/T 822 2011 2 DEPC diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯。 EB
6、 Ethidium bromide， 溴化乙锭 。 5 检测方法 除另有规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水均为蒸馏水，规格符合 GB/T 6682的相关规定。 5.1 试剂 5.1.1 变性液 :见附录 A.1。 5.1.2 2 mol/L 醋酸钠溶液 (pH4.0)：见附录 A.2。 5.1.3 水饱和酚（ pH 4.0）。 5.1.4 氯仿 /异戊醇（ 49/1）混合溶液。 5.1.5 AMV 反转录酶（ 200 U/ L）。 5.1.6 RNA 酶抑制剂 (40 U/ L)。 5.1.7 Taq DNA 聚合酶 (5 U/ L)。 5.1.8 1.0% 琼脂糖凝胶：见附录 A.3
7、。 5.1.9 50 TAE 缓冲液：见附录 A.4。 5.1.10 溶液 (10 g/ L)：见附录 A.5。 5.1.11 加样缓冲液：见附录 A.6。 5.1.12 DEPC 处理的灭菌双蒸水：见附录 A.7。 5.1.13 异丙醇。 5.1.14 DEPC 处理的灭菌双蒸水配置的 75%乙醇：见附录 A.8。 5.1.15 5AMV 缓 冲液 5.1.16 2.5 mmol dNTPs 5.1.17 10PCR 缓冲液 5.1.18 DNA 分子量标准。 5.1.19 引物：见附录 A.9。 5.2 仪器设备 5.2.1 高速冷冻离心机：最高转速 应 大于 12 000 rpm。 5.
8、2.2 PCR 扩增仪。 5.2.3 核酸电泳仪和水平电泳槽。 5.2.4 恒温水浴锅。 5.2.5 2 8冰箱和 -20 冰箱。 5.2.6 微量移液器（ 0.5 L 10 L； 2 L 20 L； 20 L 200 L； 100 L 1 000 L）。 5.2.7 真空干燥器（非必备）。 5.2.8 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 DB33/T 822 2011 3 5.2.9 超净工作台或通风橱。 5.3 操作程序 5.3.1 样品的采集和处理 选择代表性病症的病死猪 ，无菌采集 肺、脾 、淋巴结 和扁桃体等组织 ；常规监测临床健康待检猪可采集血清或淋巴结。 0 以下冷藏并在 4 h内送
9、至实验室检测 ，或在 -20 的环境中保存备用。 5.3.2 RNA 的提取 5.3.2.1 RNA 提取方法 RNA的提取方法采用 异硫氰酸胍一步法 ，也可采用 TRIZOL法或者 市售商品化 RNA提取试剂盒 。注意事项 参 见附录 B1。 5.3.2.2 异硫氰酸胍一步法 步骤 5.3.2.2.1 每次试 验前应设立阳性 、阴性和空白对照。取组织样品进行研磨匀浆后冻融 2 次， 12 000 rpm/min 离心， 5 min。 5.3.2.2.2 取 100 L 组织匀浆 上清 ，加入变性液 300 L 颠倒混匀，继续加 入 30 l 2mol/L 乙 酸钠（ pH 值 4.0）。反复
10、颠倒离心管 5 次， 一般在 25 的 室温 下 放置 5 min。 12000 rpm/min、 4 离心并取上清。 5.3.2.2.3 再依次 加入 150 L 饱和 酚 、 150 L 氯仿 -异戊醇 ，然后 盖上管盖， 反复 颠倒混匀 5 次，冰浴 15 min。 5.3.2.2.4 然后以 12 000 rpm/min、 4 离心 20 min，将上层含 RNA 的水相移入一新管中 ，不应 吸取水相的最下层。 5.3.2.2.5 加入等体积的异丙醇， 颠倒混匀 ， 冰浴静置 10 min 沉淀 RNA。 5.3.2.2.6 12 000 rpm/min、 4 离心 10 min，弃上
11、清 。 5.3.2.2.7 加入 1 mL 用 DEPC 水配制的 75%乙醇 颠倒混匀 洗涤沉淀， 12 000 rpm/min、 4 离心 10 min，弃上清 。 5.3.2.2.8 将含有 RNA 沉淀的离心管静置 干燥沉淀 5 min 10 min， 然后用 20 L DEPC 处理水 将沉淀充分溶解，在 -20 条件下保 存备用。 5.3.3 RT-PCR 操作步骤 5.3.3.1 反转录 5.3.3.1.1 反转录 引物使用 下游引物 PRRST2， 42 反应 1.5 h，合 成 cDNA 链 。 20 L 反转录体系 中包括： RNA模板 5 L RNA酶抑制剂 (40U/L
12、) 0.5 L 5 AMV Buffer 4 L 2.5mmol dNTPs（ 2.5 mmoL/L） 4 L DB33/T 822 2011 4 下游引物 PRRST2（ 20 pmoL/L） 1 L AMV反转录酶 0.5 L DEPC水 5 L 总计 20 L 5.3.3.1.2 使用商品化的反转录试剂盒也可按试剂盒使用说明进行。 5.3.3.2 PCR 扩增 5.3.3.2.1 使用特异性引物对 cDNA 进行 PCR 扩增， PCR 反应条件为 95 预变性 5min， 30 个 循环，每个循环包括： 94 变性 30 s， 55 退火 50 s， 72 延伸 1 min。 最后 7
13、2 延伸 10 min 结束 。 PCR产物以 1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定。其中需加入抽提的阴性、阳性和空白对照作为参照。 25 L 的 PCR 反应体系中包括： 10 PCR buffer 2.5 L dNTPs（ 10 mmol/L） 2 L 上游引物 PRRST1（ 20 pmoL/L） 0.5 L 下游引物 PRRST2（ 20pmoL/L） 0.5 L DNA聚合酶 (5 U/L) 0.5 L cDNA 3 L 灭菌三蒸 /超纯水 16 L 总计 25 L 5.3.3.2.2 RT-PCR 操作过程中的注意事项 参 见附录 B.2。 5.3.3.3 电泳 5.3.3.3.1 制备 1.
14、0%琼脂糖凝胶板，见附录 A.3。 5.3.3.3.2 取 5 L PCR 产物与 0.5 L 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 5.3.3.3.3 电泳时加入 DNA 分子量标准对照 。 5.3.3.3.4 盖好电泳仪，插好电极， 电压 110 V，电泳 20 min 30 min。 5.3.3.3.5 用紫外凝胶成像仪 或紫外透射仪观察扩增结果 。 5.3.3.3.6 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小 。 6 结果判定 6.1 阳性、阴性对照检测结果 在阳性对照出现 421 bp（ HP-PRRSV） /511 bp（美洲型）的 扩增带、阴性对照无 相应目标条带，该次检测
15、成立，并 判定结果。 6.2 待检样品检测结果 待检样品出现 421 bp 的扩增条带，判定为 HP-PRRSV 阳性；待检样品出现 511 bp 的扩增条带，判定为美洲型 PRRSV 阳性；同时出现 421 bp、 511 bp 的目标条带，则判定为 HP-PRRS 和美洲型 PRRSV 双阳性。没有出现 421 bp 和 511 bp 条带 则判定为 高致病性蓝耳病和经典美洲型猪蓝耳病病毒 阴性。 DB33/T 822 2011 5 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 变性液 将 250 g异硫氰酸胍、 17.6 mL0.75 mol/L（ pH7.0）柠檬酸钠和
16、26.4 mL 10%（ m/V）十二烷基肌酸钠溶 293 mL水中。 65 条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件 下保存，每次 使 用前按每 50 mL变性液加入 0.36 mL的 14.4 mol/L的 -巯基乙醇。变性液可在室温下避光保存 6个 月。 A.2 2 mol/L 乙 酸钠溶液 (pH4.0) 在 100 mL容量瓶中，先加入 16.4 g 乙酸钠 ，加入适量 灭菌双蒸水 ，再用 冰乙酸调 pH至 4.0后定容。 A.3 1.0%琼脂糖凝胶的配制 用 琼脂糖 1.0 g， 0.5TAE 电泳缓冲液 100 mL，混匀后在 微波炉中完全融化，待冷至 50 60 时，加 EB溶
17、液 5 L，摇匀倒入电泳板上，凝固后取下梳子，备用。 A.4 50TAE电泳缓冲液 A.4.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠 (EDTA)溶液 (pH8.0) 在 100 mL容量瓶中，先加入 EDTA 18.61 g，加入适量 灭菌双蒸水 ，再用 氢氧化钠调 pH至 8.0时定容。 A.4.2 TAE电泳缓冲液 (50)配制 羟基甲基氨基甲烷 (Tris) 242 g、 冰乙酸 57.1 mL、 0.5mol/L EDTA溶液 (pH8.0) 100 mL，加 灭菌双蒸水至 1 000 mL充分混匀。 用时用灭菌双蒸水稀释使用 。 A.5 EB溶液 EB 20 mg、加 灭菌双蒸水至
18、 20 mL充分溶解混匀而成。 A.6 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g、 溴酚 蓝 0.1 g、 二甲苯青 0.1 g，加 灭菌双蒸水 至 100 mL充分溶解混匀而成。 A.7 DEPC水 DEPC 100 L，加超纯水至 100 mL， 室温过夜， 121 高压 15 min，分装到 1.5 mL DEPC处理过的微量管中 ，冻存备用 。 DB33/T 822 2011 6 A.8 75%乙醇 用 75 mL无水乙醇，加 DEPC水至 100 mL，混匀， 4 保存备用。 A.9 引物 A.9.1 HP-PRRSV和美洲型 PRRSV检测引物序列如下表 A.1。 表 A.1 HP-PRR
19、SV 和美洲型 PRRSV 检测引物序列 引物名称 序列 上游引物 PRRST1： 5 -ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3 上游引物 PRRST2： 5 -GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3 A.9.2 引物合成后短期内可 4 存放，需长期保存应冻存于 -20 。待用时应稀释至 20 pmol浓度。 扩增时 2条引物在同一体系中，扩增结束后出现大小为 421 bp的目的片段为 HP-PRRSV， 大小为 511 bp的目的片段则为美洲型 PRRSV。 DB33/T 822 2011 7 B B 附 录 B （资料性附录） 检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施 B.1
20、 样品处理和核酸制备 B.1.1 样品处理过程中 应 穿实验服，戴一次性手套、口罩、帽子 。 一次性手套 应 经常更换。 B.1.2 提取 RNA过程或 PCR反应液配制过程应分别在专用的超净工作台 内 进行； 未设 专用超净工作台时可选取一个相对洁净的专用区域。 B.1.3 所有抽提 RNA的试验器皿、离心管、 PCR管等应进行 DEPC水处理。 B.2 RT-PCR检测过程 B.2.1 实验前后， 应将 超净工作台的紫外灯打开 照射 30 min；也可用 10%次氯酸钠溶液擦拭工作台面，应 保持工作台面和环境的清洁干净。 B.2.2 抽样和制样工具 应 清洁干净，经无菌处理过， PCR试验的器皿、离心管、 PCR管等 应 DEPC水处理后， 121 ， 15 min高压灭菌 并烘干后 才可使用。 B.2.3 在进行 PCR扩增前 ，各 PCR管盖 应盖紧，采用热盖加热（ PCR管中不加石蜡油）的 PCR扩增仪还 应检查 PCR管放入加热槽后高度 的 一致 性 。 B.2.4 PCR反应混合液配制、 RNA提取、 PCR扩增、电泳和结果观察等应分区或分室进行，实验室运作应从洁净区到污染区单方向进行。 B.2.5 所有的试剂、器材、仪器都应专用，不 应 交叉互用。 _
