1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1840-2006 植物病毒免疫电镜检测方法Method for detection of plant viruses by immuno-electron microscopy 2006-11-10发布2007-05-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检菇总局前言本标准由圄家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位z中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陈枝楠、郑耘、邓琼、王伍、顾光吴。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T 1840-2006 I SN/T 1840一-2006植物病毒免疫电镜检测方法1
2、 范围本标准规定了植物检疫中对植物病毒的免疫电镜检测方法。本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料和植物产品中植物病毒的免疫电镜检测。2 原理免疫电镜CImmuno-electronmicroscopy, IEM)是免疫学原理与电镜负染技术相结合的方法。通过包被在铜网上的抗体从含有病毒的植物组织粗提液中特异地、高效地捕捉病毒粒体，经乙酸铀染色，在透射电子显微镜下可以清晰观察到病毒粒体形态结构及其外部的抗体晕圈，为在超微结构水平下对植物病毒进行鉴定提供了抗原形状和血清学特性的信息。3 仪器设备和用具3. 1 微量榨汁机。3.2 高速冷冻离心机。3.3 植物光照培养箱(植度可调范围oOC500C)。3
3、.4 电子分析天平(感量:O. 001 g)。3.5 pH计(测量精度:士O.05pH) 0 3.6 透射电子显微镜(放大倍数:20万倍)。3. 7 研钵、离心管(1.5 mL)、锢网(400目)、滴管、尖头小慑子、Whatman滤纸、塑料培养皿、洁净玻璃片、Parafilmo4 试荆及溶液4. 1 样晶提取缓冲液将50mL O. 1 mol/L Tris碱梅掖与17.2mL的0.1mol/L盐酸(HCD泪合，再加人蔚糖13.68g 和氯化饷(NaCDO. 88 g，用灭菌蒸馆水定容至100mL，配制成0.05mol/L Tris-HCICpH 8.4)样品提取缓冲准。4.2 Tris-HCI
4、援;中液将50mL O. 1 mol/L Tris碱踏破与44.7mL的0.1mol/L盐酸CHCDt昆合，用灭菌蒸悟水定容至100 mL，配制成浓度为0.05mol!L Tris-HCl援冲液CpH7.2)。4.3 磷酸缓冲液将被度为1mol/L的磷酸氧二铀CNa2HP04)榕液57.7mL和被度为1mol/L磷酸二氢铀CNaH2P04)播班42.3mL均匀混合，加入灭菌蒸锢水定容至1000mL，配制成0.1mol/L磷酸缓冲液母掖CpH7.0)。使用时，将上述母液用灭菌蒸锢7(稀释5倍，配制成0.02mol/L磷酸缓冲液CpH7.0) , 备用。4.4 Formvar膜将聚乙烯醇缩甲醒溶于
5、三氯甲烧，配成0.25%溶液，贮存于冰箱内备用。制膜时取一块洁净的玻璃片插入溶被中，取出倾斜放置，待三氯甲:境挥发后，在玻璃片上形成一层薄膜，用慑尖沿玻璃边缘划破薄膜，再将政璃片倾斜漫入灭菌蒸锢水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取洁净的铜网光面向下轻轻地摆放在上面，压紧，再用一块Parafilm覆盖其上，捞起后置于培养皿内，干燥备用。l SN/T 1840-2006 4.5 z;酸铀染色液称取0.5g乙酸政氧铀，溶于灭菌蒸锢水中，定容至25mL，配制成2%乙酸铀染色破，置于40C冰箱中备用。乙酸铀染色液最好使用前配制。4.6 种子表面消毒渡配制3%次氯酸呐?肖毒液。4. 7 免疲学检测
6、试剂可采用商品化的5 免疫电镜检测鉴定.5.1 样晶制备5. 1. 1 种子类在实验室检测样品中，随机抽取或针对性菌蒸铺水洗海三次，将种子置于铺有吸水内在适宜的发芽温度条件下(200C2 观察是否表现相关病毒病症状。采集表现症状植株病叶加人样品提取缓冲破，在微毒粗提液，每一植株制备一对于外部形状为球状人样品提取缓冲破，经研磨子表面消毒掖消毒10min后，用灭将种子分列其中，放于植物光照培养箱至花盆中培养，待长出第3片4片真叶时，0.5 mL)中，制成植物病1 : 3(质量:体积)比例如如果发现有可疑相关病毒病症状的种子，可在进行表面消毒后，直接用灭菌蒸俑水漫泡种子，待种皮泡软后(约12h24
7、h) .经研磨制备植物病毒粗提液(方法同上)。5. 1. 2 鳞球(块)茎类在实验室检测样品中，随还要打破休眼)，放于植物光对发现有可疑病毒如果发现有病毒病相法同5.1. 1)。5. 1. 3 种苗类随即抽取20株种苗(方法同5.1. 1)。5.2 操作步骤5.2. 1 将上述制备的待测悬液。5.2.2 取上清液(病毒悬液), 病毒悬液中病毒眼皮确定。5.2.3 用Tris-HCl缓冲液将抗血清稀释200倍l000 倍。或块茎芽眼(处于休眠状态的、培养，并观察叶片症状。(方法同5.1.1)。制备植物病毒粗提液(方日卡制备植物病毒粗提液10 min，上清液即为病毒用。具体稀释倍数视待检恻5.2.
8、4 在塑料培养皿内滴加一滴经稀释的抗血清，将铜网有膜的一面扣在抗血清的液滴上，在室温(250C)下静置30mino 5.2.5 用尖头小慑子轻轻夹起铜网，用Whatman滤纸片吸去铜网上残余的抗血清，然后用滴管滴20滴Trs-HCl缓冲液洗涤铜网，再用滤纸片吸去蔽体。5.2.6 在塑料培养皿内滴加一滴待检样品的病毒悬液，移扣铜网有膜的一面到此液滴上。在塑料培养皿内放置一片温润的Whatman惊纸条防止水分蒸发，盖紧培养皿上盖，在室温(250C)下静置1h4 h。2 SN/T 1840-2006 如果是不稳定的病毒最好选择在40C条件下静置1h4 ho 5.2.7 滴三滴样品提取缓冲液在铜网上终
9、止抗体捕捉病毒反应，再用滴管滴30滴灭菌蒸锢7(冲洗铜网。5.2.8 在塑料培养皿内滴一滴经磷酸缓冲液稀释的抗血清(一般稀释50倍100倍);将铜网移扣到抗血清液滴上，置于室温(250C)下15min，先用20滴Tris-HCl缓冲破洗涤铜网，再用30滴灭菌蒸锢水冲洗铜网，最后用惊纸吸干铜网上的液体(本步骤适用于球状植物病毒)。5.2.9 在塑料培养皿内滴一滴乙酸铀染色液，将铜网移扣到染色液滴上染色10min，用滤纸吸去多余的染色液，室也下风干，置于透射电子显微镜下观察病毒粒体的形态结构和大小。5. 2. 10 记录和描述病毒粒子形态、结构、长度和直径，并拍摄病毒粒子照片。5.3 免擅电镜结果
10、判定在电镜下，可以直接观察到病毒板子形态、大小及其周围由抗血清所形成的抗体晕周。如果要对病毒确证，可结合待检植株样品的症状表现、生物学特性、血清学反应或分子生物学检测结果进行鉴定。6 样晶的保存与复核种子类样品保存6个月，如发现待测病毒样品保存1年。其他繁殖材料中发现病毒的，采集病叶经液氮干燥后在一200C条件下保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便必要时复核。UDON-0寸FHZ中华人民共和国出入境检验检疫行业标准植物病毒免瘟电镜检测方法SN/T 1840-2006 4峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码，100045网址电话，68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷68517548 印张O.5 字数7千字2007年3月第一次印刷1/16 2007年3月第一版印数1-2000开本880X1230 JG 定价6.00铃书号，155066 2-17504 1840-2006
