1、ICS 7104099N 53 囝亘中华人民共和国国家标准GBT 1 8873-2008代替GBT 18873-2002生物薄试样的透射电子显微镜一X射线能谱定量分析通则General guide of transmission electron microscope(TEM)一X-ray energy dispersivespectrometry(EDS)quantitative microanalysis for thin biological specimens20080616发布 200903-0 1实施丰瞀嬲紫瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”GBT 18873-2008目
2、 次前言”1范围-2术语和定义3基本原理-4仪器和设备5生物薄标样的选择6生物薄试样7准备工作8选择仪器测量条件9测量分析步骤一10误差11分析结果的发布附录A(资料性附录) 生物组织G因子计算法参考文献【；l122233456前 言GBT 18873-2008本标准代替GBT 18873 2002生物薄试样的透射电子显微镜一x射线能谱定量分析通则。本标准与GBT 18873 2002相比主要变化如下：生物薄试样的厚度范围定在50 nm300 nm(2002年版的21、22；本版的21、22)；对生物薄试样的常见元素测试时，推荐的加速电压值定为35 kV80 kV(2002年版的712、81；
3、本版的712、81)；机械推进式超薄切片机改成超薄切片机(2002年版的4、52；本版的4、52)；不推荐使用金网(2002年版的53、62；本版的53、62)；建议在电镜冷阱中加入液氮或使用冷冻样品台(2002年版的716；本版的716)。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国微束分析标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学上海医学院、上海市计量测试技术研究院、中国人民解放军军事医学科学院。本标准主要起草人：杨勇骥、俞彰、张训彪、张德添。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 18873-2002生物薄试样的透射电子显微镜一x射线能谱定量分析通
4、则GBT 18873-20081范围本标准规定了透射电子显微镜一x射线能谱仪定量分析生物薄试样的技术要求和规范。本标准适用于生物薄试样所含非超轻元素的透射电子显微镜x射线能谱定量分析。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。21生物薄试样biological thin specimen指采用超薄切片机切成的、厚度为50 nm300 nm的生物试样。22生物薄标样biological thin standard specimen指采用超薄切片机切成的、厚度为50 nm300 nm的生物标准样品。23G因子(或平均加重权)G factor(or average aggravating weight
5、)生物试样和生物标样的化学组成成分的元素因子。G因子可用式(1)计算得到：G一C。z；A， (1)式中：c。薄试样或薄标样化学组成中元素i所占的质量百分比；z：元素i的原子序数；A元素i的原子量。3基本原理用聚焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，该区域中所含元素的原子受到高能电子束的激发产生特征x射线，其特征x射线能量对应于相关的元素；特征x射线的积分强度对应于元素的浓度。采用能谱仪将接收到的样品特征x射线峰强度与背景强度(即连续x射线强度)之差与在相同条件下电子束照射生物薄标样获得的特征x射线峰强度与背景强度之差进行比较，确定被测生物薄试样激发区域内各元素的含量。4仪器和设备透射电子显微
6、镜；x射线能谱仪；超薄切片机。5生物薄标样的选择51 生物薄标样的化学成分要尽可能地与被分析生物薄试样相似，且有化学成分定值。52生物薄标样的厚度与被分析生物薄试样的厚度应相近，建议采用超薄切片机切成的厚度小于1GBT 18873-2008300 nm的生物薄标样。53生物薄标样所用的载网应是直径3 mm的电镜用标准载网，推荐使用碳载网或尼龙载网。54用于制备生物薄标样的基质材料，其G因子应接近于生物软组织的G因子为328。55标样应具有较高的抗电子辐射及抗污染的能力。6生物薄试样61 生物薄试样的厚度应小于300 nm，建议采用超薄切片机切成的生物薄试样。62生物薄试样所用的载网应是直径3
7、mm的电镜用标准载网，推荐使用碳载网或尼龙载网。7准备工作71电子显微镜系统711 开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30 min以上。712选择测试薄标样所需的加速电压，检测生物薄试样所需的加速电压应选择在35 kv80 kV之间。713调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。714对电子光学系统进行对中调整，使电子显微镜处于最佳工作状态。715在定量分析过程中，不能再对电子光学系统进行对中调整。716建议在电镜冷阱中加入液氮或使用冷冻样品台，以减少样品污染。72能谱分析系统721开机，一般预热30 rain左右。722在不加电镜加速电压的条件下，检测x射线能谱仪的背景计数
8、率，背景计数率应小于60 cps。723 x射线能谱仪的能量漂移范围在工作时间内应小于10 eV。如峰位漂移较大，可调节能谱仪中的零位调节系统，使峰位漂移小于10 eV。724校检脉冲处理器的状态，调节增益，并使噪音信号尽可能减小。725定量分析前，必须校检能谱仪的分辨本领。用Mn等标样检查Be窗探测器；用含F标样检查超薄窗探测器低能端的分辨本领。726检查所得结果，手动或自动输入到计算机中，以备定量分析时调用。注：如仪器有自动校正程序，则不需执行723和724。8选择仪器测量条件81选择加速电压因大多数生物试样在高加速电压下极易受损，如使用透射电镜对生物试样中常含的原子序数小于32的元素(如
9、Na、Mg、P、S、C1、K、Ca等)进行测试时，推荐的加速电压值为35 kV80 kV。82选择电子束束流在确定的加速电压下，选择电子束束流使x射线的计数率在800 cps3 000 cps。83选择电子束束斑直径831 保证电子束束斑产生的激发区尺寸不超过待分析区的尺寸，且被分析元素的特征x线的强度足够高(能达到预期的分析精度)。832推荐采用的电子束束斑直径：对生物薄试样检测分析可采用正聚焦，束斑直径小于05 v-m。如欲测量较大区域的元素成分，可采用相应的散焦束斑。如欲测量较小区域的元素成分，也可采用直径更小的电子束束斑。84选择被分析元素的线系841被分析元素的原子序数z32时，采用
10、K线系。2GBT 18873-2008842被分析元素的原子序数72Z32时，采用L线系。843被分析元素的原子序数Z72时，采用M线系。844选择不受重叠峰和逃逸峰重叠的谱线，在确定有峰重叠时应作谱峰剥离。85选择能谱仪收谱计数时间能谱仪收谱计数时间一般为100 s。在测量低浓度含量元素并有精度要求时，应适当延长计数时间，并满足式(2)的要求：N。一Nb3(Nb)”2 (2)式中：N。该元素谱峰处计数；Ne背景计数。9测量分析步骤91确定分析部位911 在透射电子显微镜或扫描透射电子显微镜中寻找试样的分析部位，确定后将分析部位置于电子显微镜的观察中心。912使电子束会聚，并保持图像清晰，调整
11、电子束束斑到观察荧光屏的中心位置上，并使分析部位置于荧光屏的中心位置上。在寻找标样和试样时只能移动x、y轴，不能调整电子光学系统(包括物镜聚焦)。92定性分析选用适当的加速电压和计数时间，收谱后采用峰鉴别检查试样中所含元素的种类。93建立标准样品数据库根据定性分析结果，建立或调用相应的标准样品的数据文件。建立被分析样品的文件清单(元素、线系、测量条件、处理模式)等。931在完全一致的测量条件下(束流、加速电压、计数时间、放大器的增益、束斑大小及检出角)收集标准样品的x射线谱线，并可根据不同类型的试样建立不同类型的标样数据库。如测量条件发生变化，应建立新的标样数据库。932在对试样定量分析前，应
12、调用相应程序测量有关标准样品，其分析结果的误差应小于允许误差。94定量分析941根据试样的特征，采用完全一致的测量条件及调人生物x射线能谱定量分析程序，建立分析试样所需的标准样品数据文件。942选用与已建立的标样数据库完全一致的测量条件进行谱的采集。943重叠谱峰剥离。如有谱线重叠时，应进行重叠峰的剥离。必要时应使用成分相近的标样进行验证。944背景测量。用设置两个背景窗口的方法进行背景扣除，背景窗口建议设置在感兴趣元素谱峰的附近两侧，如感兴趣元素较多，应尽可能将背景窗口分别设置在感兴趣元素谱峰的高、低能量段处。或用手动背景划线法扣除背景。945计算各元素的特征x射线相应强度比，并计算出试样中
13、各元素的相应含量。10误差101误差计算公式在发布分析结果时，应同时给出生物薄试样定量分析的相对误差值，其相对误差值的计算公式如式(3)：3GBT 18873-2008 肛弼eCb式中：cb标样元素浓度；e试样元素浓度；n测量次数；N扣除背景的被测元素的计数平均值。102为减小相对不确定度值，建议选取浓度值较低的标样作为测试用标样。11分析结果的发布”1 定量分析结果的报告应包括以下信息：a)分析报告的唯一编号；b)分析报告的页码；c)分析报告的日期；d)实验室名称和地址；e)送样人姓名，单位和地址；f)样品的接收Et期；g)样品原编号，分析编号及样品特征的描述；h)分析所依据的标准方法；i)
14、选用标准样品的种类、级别、浓度、G因子；j)分析结果和必要的相对误差值；k)分析仪器及其工作条件，所用标样等1)分析报告负责人的签字。112生物薄试样内非超轻元素的能谱探测极限约在01 mmolkg左右，对低于01mmolkg浓度的元素定量分析值应有分析方法的补充说明。A1导言附录A(资料性附录)生物组织G因子计算法GBT 1 8873-2008本附录给出了生物组织、生物标样G因子的计算方法。并已计算出了透射电镜一x射线能谱仪常测试的生物软组织的G因子。A2生物组织的G因子计算生物软组织的G因子计算法如式(A1)：Gz2A一C,Z；A。1式中：z元素的原子序数；A元素的原子量；c：薄试样或薄标
15、样化学组成中元素i所占的质量百分比z：、A分别为元素i的原子序数与原子量。A3生物软组织的G园子计算生物软组织的元素、所占质量百分比及计算结果如表A1。表A1 生物软组织的元素、所占质量百分比及计算结果元素 质量百分比 孑 A 罾A C。z：A。H 007 1 l 1 007C 005 36 12 3 150N 016 49 14 3 5 056o 025 64 16 4 I00S+P 002 240 315 77 015孑A=GZiA。 328A4生物软组织的G因子由表A1，生物软组织的G因子为328。5GBT 18873-2008参考文献1Hutchinson TEMicroprobe a
16、nalysis of biological systemsNew York：Academic Press，1981EzHall TA，Anderson HC，Appleton TThe use of thin specimens for Xray microanalysis in biologyJ Microsc，1973：9917733杨勇骥，郑尊，夏愿耀建立一种新型Agarose薄标样一应用于生物EDX定量分析第二军医大学学报，1991：12674Chandler JAA method for preparing absolute standards for quantitative ca
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