1、ICS 65.020.30 B 43 道B中华人民圭t./、和国国家标准GB/T 26612-2011 纯血马DNA亲子鉴定技术规程Procedures of Thoroughbred parentage verification with DNA testing techniques 2011-06-16发布2011-11-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准纯血马DNA亲子鉴定技术规程GB/T 26612-2011 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:68523946685
2、17548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 开本880X12301/16 印张O.75 字数17千字2011年9月第一版2011年9月第一次印刷 书号:155066. 1-43407定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有僵权必究举报电话:(010)68533533前言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业大学马研究中心、中国马业协会。本标准主要起草人:赵春江、吴常信、韩国才、张浩、吴克亮、杜丹、韩文朋。G/T 26612-2011 I 纯血马D
3、NA亲子鉴定技术规程1 范围本标准规定了纯血马DNA亲子鉴定所用的方法、过程、结果的记录和解读等。本标准适用于纯血马的亲子鉴定。2 规范性引用文件G/T 26612-2011 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GA/T 383 法庭科学DNA实验室检验规范SN/T 1119 进口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR方法SN/T 1193 基因检验实验室技术要求3 术语和定义
4、下列术语和定义适用于本标准。3. 1 纯血马Thoroughbred 符合国际纯血马登记委员会CInternationalStud Book Committee, ISBC)规定、在ISBC批准的成员国登记委员会登记了的马匹。3.2 微卫星DNA亲子鉴定方法parentage testing with DNA technique 以微卫星DNA多态性及孟德尔遗传规律为基础的亲子鉴定方法。4 原理根据微卫星DNA的侧翼序列设计引物，对微卫星DNA位点进行扩增，其中包括国际动物遗传协会CInternationalSociety of Animal Genetics , ISAG)和ISBC要求的九
5、个微卫星位点。通过凝肢电泳判定个体的基因型。根据孟德尔遗传规律，比对亲代个体和子代个体各微卫星DNA位点的基因型是否相符，从而达到亲子鉴定的目的。5 试剂与器材5. 1 试剂5. 1. 1 乙醇(ethanol)，分析纯。5.1.2 异丙醇(isopropanol)，分析纯。5.1.3 氢氧化铀(NaOH)，分析纯。5. 1.4 乙二肢四乙酸二铀(EDTA)，分析纯。5. 1.5 氯化铀(NaCl)，分析纯。5. 1.6 十二烧基硫酸铀(SDS)，分析纯。5. 1.7 乙酸锦(CH3COOK)，分析纯。5.1.8 氧化钮(LiCl)，分析纯。1 GB/T 26612-2011 5. 1. 9
6、氯化饵(KCl)，分析纯。5. 1. 10 氯化镜(MgClz)，分析纯。5. 1. 11 30% (质量分数)丙烯酷股溶液z将29%丙烯眈胶和l%N，N人亚甲双丙烯酷胶溶于去离子水，充分搅拌溶解并过滤去杂质，避光保存。5. 1. 12 过硫酸镜，分析纯。5. 1. 13 跚酸(boricacid) ，分析纯。5. 1. 14 乙酸，分析纯。5. 1. 15 甘油，分析纯。5. 1. 16 四棚酸锅，分析纯。5. 1. 17 硝酸银(AgN03)，分析纯。5. 1. 18 甲醒，分析纯。5. 1. 19 漠化乙链，分析纯。5.1.20 Taq DNA聚合酶。5. 1. 21 澳酣蓝，分析纯。5
7、. 1. 22 盐酸(HCl)，分析纯。5.1.23 三(是基甲基氨基甲:皖CTrisBase) ，分析纯。5. 1. 24 Tris-HCl:由TrisBase和HCl组成的缓冲榕液。5.1.25 三磷酸脱氧核昔酸混合物(dNTPs):等量的三磷酸鸟喋岭脱氧核昔酸(dGTP)、王磷酸腺瞟岭脱氧核昔酸(dATP)、三磷酸胸腺嘻睫脱氧核昔酸(dTTP)、三磷酸胞喃睫脱氧核昔酸CdCTP)的混合物。5.1.26 毛囊裂解液:200 mmol/L NaOH 0 5. 1. 27 中和液:200mmol/L HCl,100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.5 0 5. 1. 28 缓冲液:a
8、) 血液裂解缓冲液(BufferA): 100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.日，100mmol/L EDTA , 100 mmol/L NaCl，O.5%(质量分数)SDS;b) 蛋白沉淀缓冲液(BufferB) : 200 mL 5 mol/L CH3 COOK, 500 mL 6 mOl/L LiCl t昆匀后使用pc) DNA溶解缓冲液(TE):10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH=8. 0; d) 电泳解缓冲液5XTBE:446mmol/L Tris Base , 445 mmol/L Boric Acid , 10 mmol/L E
9、DTA (pH 8.0); e) 电泳解缓冲液50XTAE:2mol/L Tris碱，1mol/L冰乙酸，0.1mol/L EDTA(pH 8.0); f) 上样缓冲液:30 mmol/L EDTA , 36% (体积分数)丙三醇，0.05%(质量/体积分数)澳酣蓝，pH=7.0; g) 10XPCR缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) ,0.5 mol/L KCl , 15 mmol/L MgClz。5.1.29 琼脂糖(分析纯)。5. 1. 30 N ，N，町，N-四甲基乙二胶(TEMED)。5. 1. 31 琼醋糖胶:琼脂糖加入电泳解缓冲液，加热熔解冷却后制成的
10、胶状物，可用于DNA电泳。5.2 器材5.2.1 全自动DNA分析仪。5.2.2 离心机，离心力10OOOg 0 5.2.3 紫外可见分光光度计。5.2.4 移液器，量程O.1Ll 000L。5.2.5 PCR仪，96孔热循环。5.2.6 水平电泳槽，长度31cm。5.2.7 垂直电泳槽，长度24Cffi o 5.2.8 凝胶成像系统。5.2.9 被涡振荡仪。5.2. 10 剪刀。6 DNA亲子鉴定规程6.1 DNA的提取GB/T 26612-2011 采取血液或带有毛囊的马毛发，从中提取DNAo具体方法参见附录AoDNA样品操作注意事项见SNjT11190 6.2 亲子鉴定所用DNA微卫星佐
11、点亲子鉴定所用DNA微卫星位点应包括ISAG和ISBC要求的如下九个微卫星位点:AHT4，AHT5 , ASB2 , HMS3 , HMS6. HMS7 , HTG4 , HTG10. VHL20。在所扩增的位点中还可包括HTG6 , HTG7 ，HMS2等三个微卫星位点或其他若干个已被证实在纯血马群体中多态性丰富的微卫星位点，以进一步提高亲子鉴定的准确性。引物序列参见附录Bo6.3 DNA微卫星位点的扩增可用荧光物质标记用于扩增上述12个位点的引物，采用PCR方法扩增这些微卫星位点。PCR条件参见附录CoPCR操作中防止污染等注意事项见GAjT3830 6.4 基因型的检测使用根据荧光信号探
12、测PCR产物大小的全自动DNA分析仪或聚丙烯酷胶凝肢电咏后银染(参见附录D)等可检测两个碱基长度差异的方法检测上述12个位点的基因型q在分析中设置对照样本。上述操作技术要求见SNjT11930 6.5 基因型的表示方法基因型用国际通用的字母表示。在所检测的微卫星位点中，等位基因数为奇数的，片段长度居中的基因型记为tM;如等位基因数为偶数，居中的两个基因型中片段较小的定义为M。其他等位基因对照M按升序排列。微卫星位点基因型的记录参见附录E。6.6 亲子关系的判断根据两亲本及子代个体的基因型判断其是否存在亲子关系。基因型的读取和亲子关系的判断由两人分别独立完成，其结果互相印证。6. 7 否定个案的
13、重复检测对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，重新采取DNA样品进行鉴定，两次鉴定结果一致方能确定为不存在亲子关系。7 亲子鉴定结果的记录7. 1 亲、子代基因型相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型相符的个案，记录亲本及子代个体的上述己测定的微卫星位点的基因型，并记录根据上述微卫星位点的基因型检测，不能排除子代个体与两亲本存在亲子关系，并由亲子鉴定负责人签字。7.2 亲、子代基因型不相符的个案鉴定结果的记录对于亲本和子代个体的基因型不符的个案，记录亲本及子代个体的上述己测定的微卫星位点的基因型，并记录根据上述微卫星位点的基因型检测，可排除子代个体与两亲本存在亲子关系，并由亲子鉴定
14、负责人签字。3 GB/T 26612-2011 附录A(资料性附录)从血液或毛囊中提取DNAA.1 马血液样品DNA的提取A. 1. 1 从马颈静脉采取血样5mL，用移液器量取100L10%(质量分数)EDTA抗凝。A. 1.2 取50L血液样品放入1.5 mL离心管中。A. 1. 3 加入400LBuffer A，充分混合至凝块消失。A. 1.4 65 oc温浴2h4 ho A. 1. 5 加人800LBuffer B，颠倒混合，然后冰浴10min(或放入一200C冰箱内5min 10 min)。A. 1.6 用离心机在室温下以12000 r/min离心15mino A. 1. 7 吸取1m
15、L上清液于另一新的1.5 mL离心管中。注意不要吸到下层沉淀物或表层漂浮物，必要时可重复离心去除沉淀物。A. 1. 8 加入600L异丙晖(isopropanol)，颠倒混合几次。A. 1.9 室温12000 r/min离心15min。A. 1. 10 弃上清液，然后用70%(体积分数)乙醇(ethanol)清洗两次，室温干燥，加人150LTE室温溶解30min。A. 1. 11 在水平电泳槽内用1.0%(质量分数)琼脂糖胶电泳检测DNA的质量;采用紫外可见分光光度计，以260/280吸光度检测DNA浓度。A. 1. 12 -20 oC保存。A.2 马毛囊样DNA的提取A. 2.1 采取马的鬓
16、毛，应该带有毛囊，10支以上。A.2.2 取0.2mL离心管，标记样品号。A.2.3 取6根10根带有毛囊的毛样，在根部用剪刀剪切约0.5cm(避免粘在剪刀上)，放入离心管中。A.2.4 加入80L毛囊裂解液(此浓度为黑毛样品的用量，栗毛加2/3浓度的毛囊裂解液)于毛囊处，游涡振荡仪上迅速璇涡混合3mino A.2.5 在PCR仪上用如下程序进行一个热循环:750C1 min, 80 oC 2 min, 90 oC 1 min,97 oC 10 mino A.2.6 从热循环仪上取下样品，加入80L中和液(此浓度为黑毛样品的用量，栗毛加2/3浓度的中和液)，被涡混合3mino A.2.7 -2
17、0oC保存。4 GB/T 26612-2011 附录B(资料性附录)用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物如表B.1所示。表B.1用于扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的引物位点名称序列(5-3)AHT4 正向:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT反向:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT AHT5 正向:ACGGACACATCCCTGCCTGC 反向:ATCTAGCAGGCTAAGGAGGCTCAGC正向:CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTGASB2 反向:GATCATATGCCCTTATCTCTTTGCGCHTG7
18、正向:CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG反向:ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT正向:CCAACTCTTTGTCACATAACAAGAHMS3 反向:CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTTHMS6 正向:GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG反向:CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCAHMS7 正向:CAGGAAACTCATGTTGATACCATC反向:TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGTHTG4 正向:CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC反向:CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTCHMS2 正向:ACG
19、GTGGCAACTGCCAAGGAAG 反向:CTTGCAGTCGAATGTGTATTAAATGHTG6 正向:CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT反向:GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCTHTGI0 正向:CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA反向:TTTTTATTCTGATCTGTCACATTTVHL20 正向:CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG反向:AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG5 G/T 26612-2011 附录C(资料性附录)扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫星位点的PCR条件C.1 PCR条件扩增纯血马亲子鉴定的12个微卫
20、星位点的PCR条件如表C.1所示。表C.1用于纯血马亲子鉴定的荧光标记引物扩增条件和扩增产物片段大小位点名称标记颜色片段大小/bp退火湿度jCMg+浓度/mmol/LAHT4 蓝色151167 60 1. 5 AHT5 黄色133147 60 1. 5 ASB2 绿色212248 60 2.5 HTG7 绿色118 128 55 2.5 HMS3 绿色150172 60 2.5 HMS6 黄色159173 60 2.5 HMS7 蓝色170186 60 2.5 HTG4 蓝色129141 55 1. 5 HMS2 黄色216238 60 2.5 HTG6 绿色84106 55 2.5 HTG1
21、0 黄色94114 60 1. 5 VHL20 蓝色87105 55 2.5 C.2 PCR反应体系PCR反应体系如下:50L反应体系:10X PCR缓冲液5L，dNTPs (5 mmol/L) 1L，引物(50mol/L)各2L，Taq DNA聚合酶(5U/t-tL) 0.5L、模板DNA10L (50 ng500 ng)、ddHzO31. 5L，扩增每个位点所需的最佳镜离子浓度参见表C.L反应条件:PCR反应条件随仪器不同略有改变。94.C预变性1min3 min. 94.C变性30s，退火30 s(扩增每个位点所需的最佳退火温度参见表C.1),72 .C延伸45s , 30个循环。72.
22、C延伸30min. 4.C保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用己知可成功扩增的马DNA样品作阳性对照;用等体积的重蒸锚水代替模板DNA作空白对照。C.3 PCR扩增产物的电泳检测PCR扩增产物电泳检测:取2.5g琼脂糖，放入100mL电泳缓冲液(将电泳缓冲液50XTAE用去离子水稀释50倍)加热充分熔解后制肢。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过凝肢。将4LPCR扩增产物和适量上样缓冲液?昆合后上样。9V/cm恒压电泳，澳酣蓝迁移至凝胶中部停止。将胶放入漠化乙链溶液(浓度为O.5g/mL)中染色15min，采用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。6 GB/T 26612-2011
23、 附录D(资料性附录)采用银染进行微卫星DNA基因型的分析方法D.1 12%(质量分数)聚丙烯膜凝胶(25mL体积，0.1cm胶条)制作及电泳D. 1. 1 清洗制胶用的玻璃板并用蒸锢水冲洗干净，晾干后上垫条，用夹子夹好。D. 1.2 在100mL烧杯内加人30%(质量分数)聚丙烯酷胶10mL, 2. 5 mL 50% (体积分数)的甘油，电泳解缓冲液5X TBE 5 mL, 10% (质量分数)过硫酸镀0.175mL , TEMED 8L，加入蒸馆水7.325 mL，混合均匀后迅速灌肢。上述为一块肢的量，多块胶时按比例加倍。D. 1.3 当灌胶至玻璃板上沿0.1cm时停止，插入梳子，室温放置
24、至其聚合。D. 1.4 凝胶聚合好后，向垂直电泳槽加入1XTBE，用注射器冲洗加样孔。D. 1.5 预电泳10min，然后上样、电泳。D.2 硝酸银染色方法D. 2.1 用去离子水冲洗肢。D.2.2 用25%(体积分数)的乙醇浸泡胶2min3 mino D.2.3 去离子水冲洗2遍。D.2.4 用0.1%(质量分数)AgN03染色液染色30min40 mino D.2.5 去离子水冲洗2遍。D.2.6 用显色液(取l臼5g N、叫aOH，加去离子水至50omL溶解，加0.076g四棚酸铀和80OL甲醒)显色1川omin、-20min D.2.7 用去离子水冲洗多余的显色液。D.2.8 显色后的
25、肢用保鲜膜封好，观察和照相。FFONlNFNH阁。GB/T 26612-2011 附录(资料性附录)纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记E 纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记如表E.l所示。表E.1 纯血马亲子鉴定微卫星DNA基因型登记表位点名称VHL20 HTG4 AHT4 HMS7 AHT5 HMS6 ASB2 HTGIO HMS3 HMS2 HTG6 HTG7 子代基因型母马基因型公马基因型子代基因型母马基因型公马基因型侵权必究句AUVE Aa&-91AA-EA - 户unhu nu FHUzd 咱EA-. 号一价书一定祷版权专有16.00 l; 26612-2011 打印日期:2011年9月29FI F002
