1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 26618-2011 派琴虫病诊断操作规程Protocol of diagnosis for Perkinsosis 2011-06-16发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2011-11-01实施发布目IJJ:I 本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。G/T 26618-2011 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、福建出入境检验检疫局、黄岛出入境检验检疫局、国家海洋环境监测中心、深圳出入
2、境检验检疫局、上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:吴绍强、林祥梅、刘建、郑腾、李西峰、梁玉波、刘盔、李建、韩雪清、贾广乐、梅琳。I GB/T 26618-2011 引派琴虫病是影响世界贝类养殖业发展的主要寄生虫病，为国际兽医局(OIE)规定的必报水生动物疫病之一。本病1946年首次报道，当时，引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蜘(Crassostrea virginica)死亡。迄今为止，已发现派琴虫存在于美洲、欧洲、澳洲、亚洲和非洲五大洲的许多贝类体内，包括牡蜘、鲍鱼、蛤子、扇贝、珍珠牡腊、鸟蛤和贻贝等体内，并在许多地区造成了严重的危害，死亡率高达95%。1997年，我国在柿孔扇贝
3、、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到派琴虫。美国2005年也从中国广西北海进口牡蜘中检出派琴虫。目前，派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主要病原之一。据对黄海北部三个海域的菲律宾蛤仔的派琴虫感染状况进行调查的结果表明，除3月份和6月份的感染率分别为95%和90%之外，其他月份感染率均为100%。目前，派琴虫感染的诊断通常依靠OIE推荐的组织切片法、FTM组织培养法以及PCR方法。组织学方法可以通过显微镜下直接观察虫体或观察组织损伤来监测感染的分布情况。FTM培养派琴虫休眠于包子的方法是将派琴虫滋养体进行培养，培养后，虫体体积增大、细胞壁增厚，而且不繁殖，是一种传统有效的定量检测派琴虫
4、的方法。实时荧光PCR检测贝类派琴虫的方法敏感度较高，而且特异性强，检测可在一天之内完成，定量准确、全封闭反应等优点。E GB/T 26618-2011 派琴虫病诊断操作规程1 范围本标准规定了派琴虫病诊断时的样品采集，虫体培养及显微镜检查，PCR以及荧光PCR检测操作规程。本标准适用于蛤仔、牡航等水生动物及其产品中携带海洋派琴虫CPerkinsus marinus)、奥尔森派琴虫CPerkinsusolseni)等派琴虫的诊断，也可用于派琴虫病的监测和流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容
5、)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样3 术语和定义3. 1 下列术语和定义适用于本标准。派琴虫病Perkinsosis 帕金虫病由海洋派琴虫CP.marinus)、奥尔森派琴虫CP.olseni)等在宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鲤、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。注:除P.marinus、P.olseni之外，病原还包括P.qug四adi、P.chesapeaki、P.a
6、ndre四st和P.mediterraneus。3.2 Ct值cyclethreshold 荧光PCR反应中，荧光信号到达设定的阔值所经历的循环数。4 材料除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。4. 1 液体琉基乙酸盐培养基Cfluidthioglycollate media，FTM):具体配制方法见附录Ao4.2 卢戈氏腆液CLugols iodine) :配制方法见附录Ao4.3 2.5%氯霉素:配制方法见附录A。4.4 1%制霉菌素:配制方法见附录A。4.5 酣-三氯甲皖抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试剂盒，见附录A。4.6 10
7、X PCR buffer、25mmol/L MgC12、dNTPC2.5mmol/L或10mmol/L)、5U/L rTaq DNA聚合酶等，均为商品化试剂盒中成分。4. 7 琼脂糖。4.8 电泳缓冲液z配制方法见附录A。4.9 引物及探针z包括PCR引物及荧光PCR引物和探针。1 GB/T 26618-2011 5 设备5. 1 低温培养箱:能够进行22oC24 oC培养。5.2 生物显微镜。5.3 -200C普通冰箱、一700C的超低温冰箱、4oC冰箱。5.4 组织研磨器。5.5 高速冷冻离心机。5.6 PCR扩增仪。5. 7 荧光PCR扩增仪。5.8 电泳仪。5.9 凝胶成像仪或紫外透射
8、仪。5. 10 水浴锅。6 派琴虫的检测方法6. 1 采样6. 1. 1 采样点的选择按照GB/T1808.8规定方法进行。应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区或者养殖易感品种的区域，应增加采样点。6.1.2 采样技术要求6. 1. 2. 1 有临床症状的贝类牡蜘感染派琴虫的症状表现为消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制、偶尔也会出现服肿，身体严重衰弱，生长迟缓等。采样时，至少挑选10条濒死的或可疑的个体。采样时贝类应当是活的，贝类应当在活体或杀死后分别包装放在冷藏的容器中送到实验室。所采集的贝类样品应避免冰冻。主要采集贝类的鲤、套膜、消
9、化腺、闭合肌等。6. 1. 2. 2 无临床症状的贝类当养殖场的个体有怀卵时，应每年在产卵期采集一次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的贝类个体组成，应选取两岁龄的贝类采样。样品应包括该地所有的易感品种。每次采样的贝类数量要以感染率等于或大于2%时检出的棋率进行抽样。通常情况是至少采集150个贝类。对元临床症状的贝类，取其鲤、套膜、消化腺、闭合肌等。6. 1. 2. 3 监测目的的采样监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的季节。采样数量参见6.1.2.206. 1. 2.4 样品保存及运送采取的样品应在取样后24h内，冷藏送入实验室，要附有标签，清楚标明采样地点、来源和养殖历史，
10、实验室内冷藏保存备检。6.2 虫体培养6.2. 1 样晶的选择选取垂死的新鲜贝类样品。6.2.2 样品前处理将贝壳弃掉，置于灭菌的研钵，剪刀剪至1mm3 mm大小。6.2.3 样品的培养将样品分别置于含5mL FTM培养基的灭菌试管中，加250L2. 5%的氯霉素摇匀，用1mL 1% 制霉菌素覆盖在液面，盖好盖子，22oC24 oC低温培养箱中暗室培养4d7 d。GB/T 26618-2011 6.2.4 样晶的纯化将培养后的样品4000 r/min离心10min，弃上清液，加6mL 2 mol/L NaOH，涡旋混匀后置于60 oC烘箱内消化过夜。4000 r/min离心10min，弃上清液
11、，加2mL ddHzO洗涤，4000 r/min离心10 min，弃上清液，重复上述步骤2次4次。6.2.5 染色镜检将纯化的样品置于2mL ddHzO中摇匀，加人80L卢戈氏腆液染色后，取40L于载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜(lOX10)下顺序观察。6.2.6 结果判断显微镜下，经过FTM培养后，派琴虫发育为休眠抱子，呈圆形，蓝黑色，直径大多在30m80m。形态参见附录Bo6.3 PCR检测6.3.1 材料选取活的或刚死的贝类的鲤组织，也可采用乙醇或者低温保存的贝类鲤组织样品。6.3.2 操作步骤6.3.2.1 DNA的提取取25mg样品，剪碎后见附录A中提取组织DNA的方法提取基因组D
12、NA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。除检测样品外，需要设立如下对照:一一一取已知感染派琴虫的贝类组织作为阳性对照;一一取未患病的贝类组织作为阴性对照;一一空白对照。6.3.2.2 引物上游引物:5 -CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3 下游引物:5 -ACA TCAGGCCTTCT AA TGA T(头3PCR预期扩增派琴虫属的ITS区域片段长度为666bp672 bpC具体序列参见附录。，引物合成后均采用灭菌ddHzO均稀释为10mol/L.-20 c保存备用。6.3.2.3 反应体系在PCR管内，加入10X PCR buffer 2. 5L、5U/-l L Taq
13、DNA聚合酶0.5L、10mol/L上下游引物各O.5L、2.5mmol/L dNTP 2L、模板DNA10L、补充ddH20至25LoPCR操作时，取等体积的ddHzO代替DNA模板作为空白对照。6.3.2.4 扩增程序95 oC预变性4min;之后95oC变性1min.53 oC退火1mn , 65 oC延伸3min，共40个循环;最后65 oC补充延伸5min。6.3.2.5 琼脂糖电泳取5LPCR扩增产物，在1X电泳缓冲液内进行1%2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用紫外灯或凝肢成像仪观察是否扩增出预期大小的特异性DNA片段。6.3.3 结果判定6.3.3.1 试验成立的条件阳性对照有
14、预期大小的扩增条带，阴性对照及空白对照没有相应片段的PCR产物。否则试验无效。6.3.3.2 样晶检测结果在阳性对照、阴性对照、空白对照都成立的前提下，若检测样品有预期大小的条带，则PCR结果阳性，若检测样品元预期大小的条带，则PCR结果阴性。3 GB/T 26618-2011 6.4 实时荧光PCR检测6.4.1 实验材料与DNA提取材料与DNA的提取以及阴、阳性对照及空白对照的设置同PCR操作部分。6.4.2 操作步骤6.4.2. 1 引物与探针设计上游引物:5-CAAACTCTCAACGATGGATGCC-3 下游引物:5-TGCAAA TCGCAGTGCTT A TCG-3 TaqMa
15、n荧光探针:5 -F AM-ACTTCGCTGCG TCCTTCA TCG A TTCTCG-ECLIPSE-3 引物和探针合成后均采用灭菌ddHzO稀释为10mol/Lo扩增片段长度为78bp(具体序列参见附录。6.4.2.2 反应体系取10L组织基因组DNA作为模板，加入按照表1配制的荧光PCR反应液中:表1荧光PCR反应液配制试剂体积/L10XPCR缓冲液CMg2+Free) 2.5 25 mmol/L MgC12 5.0 2.5 mmol dNTP 2 上、下游引物及探针(均为10mol/L)等体积混合液1. 5 5U/L Taq DNA聚合酶0.5 灭茵ddH203.5 6.4.2.
16、3 扩增程序95 oC预变性3min;然后按照如下程序进行反应:95oC变性15s , 57 oC退火1min，45个循环，每个循环结束后采集FAM通道数据。6.4.3 结果判定6.4.3. 1 试验成立判定反应结束后，仪器将自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。只有阳性对照有扩增曲线，而且Ct40的，才可判定本次试验成立，否则本次试验元效。6.4.3.2 阳性判定如果样品的PCR扩增曲线Ct35，则荧光PCR检测阳性。6.4.3.3 阴性判定如果样品无扩增曲线或者扩增曲线Ct二三40，则荧光PCR检测阴性。6.4.3.4 可疑判定如果35Ct40，判为可疑。此时可对样品重复进行
17、荧光PCR检测，如果样品重复检测的PCR扩增曲线。35，则判为荧光PCR检测阳性;如果样品重复检测时无扩增曲线或者扩增曲线Ct注40，则判为荧光PCR检测阴性。7 检测结果综合判定FTM培养发现虫体，应采用PCR或荧光PCR进行确诊。在PCR结果可疑的情况下，取PCR产物进行测序即可确诊。4 GB/T 26618-2011 附录A(规范性附录)样品DNA抽提及溶液配制A.1 样品DNA的抽提A. 1. 1 取新鲜贝类的消化腺上皮、腮、触须等组织25mg置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后称重，置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水，进行手工匀浆研磨。注意整个过程在冰上完成。A. 1.2
18、 将匀浆液倒入1.5 mL离心管中，加20L蛋白酶K(20mg/mL)，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。A. 1.3 混合液置于55.C水浴锅内水浴2.5h。A. 1.4 向匀浆液中按1: 1比例加入酣+三镇甲烧+异戊醇混合液(25+24十1)，上下颠倒混匀，12 000 r/min离心5min. A. 1.5 转移上层水相，加入等体积三氯甲烧+异戊醇混合液，上下颠倒混匀，12000 r/min离心5 min. A. 1.6 转移上层水相，加入两倍体积的元水乙醇，一20.C放置30min至过夜。A. 1. 7 12 000 r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。A. 1.8
19、于沉淀中加入75%乙醇溶液500L，轻轻混匀后12000 r/min离心5min，倾去上清液，室温凉干。A. 1.9 用20LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20.C保存备用。组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。A.2 电泳缓冲液的配制50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为:取Tris碱242g、冰醋酸57.1mL、o.5 mol/L EDT A 10 mL、用5mol/L的HCl调制pH8.0，定容至1000 mL。用前采用蒸馆水50倍稀释即可。A.3 液体琉基乙酸盐培养基(FTM)的配制称取疏基乙酸盐29.75g，放入1L蒸馆水，在微波炉中加热，直到变成金黄色
20、透明液为止，冷却后，分装于10mL的培养试管中，每管5mL，高压灭菌，冷却后，用锡宿纸包裹，放入4.C冰箱中保存备用。A.4 卢戈氏融液的配制取6g腆化饵(KI)溶于20mL ddH20中，搅拌到溶解后，加入4g棋，等腆充分溶解，再加入80 mL蒸馆水，贮存在棕色试剂瓶内待用。A.5 2.5%氯霉素的配制2.5 g氯霉素溶解于100mL ddH20中，贮存在试剂瓶内，放入4.C冰箱中保存备用。A.6 1%制霉菌素的配制1 g制霉菌素溶解于100mL ddH20中，贮存在试剂瓶内，放入4.C冰箱中保存备用。5 GB/T 26618-2011 6 飞飞飞气/ 附录B(资料性附录)派琴虫形态-苦气
21、叽、图B.1未染色的派琴虫休眠抱子(箭头所指)图B.2经卢戈氏破液染色后的派琴虫休眠于包子(箭头所指)GB/T 26618-2011 附录C(资料性附录)派琴虫PCR及荧光PCR目标扩增序到C.1 海洋派琴虫PCR扩增参考序列CCGCTTTGTTTGGATCCCCCCACCTTAACTTGTTAAGGTGATTAATTCCTATGAACCATTG TACTAGTCATAGTATCCAAATCCAATTTTGGATTTTGGTATTTCAAAACGAAATTCCAAA CTCTCAACGATGGATGCCTCGGCTCGAGAATCGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGATAAGC AC
22、TGCGATTTGCAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCATACTGCACAAAGGGG ATCTTTCCTCTTTGTACATACATATCAGTGTCGCTCTTCTTCCCGATACAAACATTTTGTT GTTAACGCAACTCAATGCTTTGTATCCCGCTTGAACTAACTCTTCGGAGGTGGTTCGTTAT GTGCGCTTGTGAAGGCAGGCGTATTAATTTGCAAGGCTATAATCTCGTATTGTAGCCCCTC CGAAAGGAGGCTTGCGCCTGTGAGTATCTCTCGAGGTACTCGCAAACTCGACTGT
23、GTTGTG GTGATATCACGTGTTCCTTGATCACGCGATTCTTCTCTTCAACGCATTACGTCAAATCTAT TGATAAATGCAGAGAAGTGTTTGAATCACGCGTTCAGTCTGGTCGCGAGATTATTATATA TCATAACACGCTTGTCGGTTTGCACCATGGCAATATGTCATCATTAGAAGGCCTGATGT C.2 奥尔森派琴虫PCR扩增参考序列CCGCTITGTT TGGATCCCCC CACCTGACCA CTCTAACGAG TCGTGTCAAG TGATATCTC CTATGAACCA TTGTACTAGT CACA
24、GTATCC AAATCCTTTT GGATT寸GGTI寸寸CAAAACGAAATTCCAA ACTCTCAACG ATGGATGCCT CGGCTCGAGA ATCGATGAAG GACGCAGCGA AGTGCGATAA GCACTGCGAT TTGCAGAIT CCGTGAACCA GTAGAAATCT CAACGCATAC TGCACAAAGA GGATC寸TCCTCTITGTACA TACATATCAG TGTCGCTCTT CTTCCCGATA CAAACATTTT G寸GT立ACGCGACTCAATG CTITGTATCC CGCTTGAGCT AGCTC寸CGGAGATAGTC
25、G TATGTGCGC TTGTGACGGC AGGCGTA:丁AAG寸GCAAGGCTATAATCTT GTATTGTAGC CCCTCCGAAA GGAGGATCGC GCCTGTGAGT GTCTGTGGAT GCTCGCAAGT CCGACTGTGT TGTGGTGATA TCACGTGTTC C寸GATCACGCGATTC寸CTCTTCAACGCA TTATGTCAAT TCTTGATGAA TGCAGAGAAG TGTITGGGTC ACGCGT寸CAGTCTGGTCGCG AGATAGAT ATATCATAGC ACGCTTGTCG GTITGCACCA TGGCAAATTG T
26、CATCATAG AAGGCCTGAT GT C.3 荧光PCR目标扩增序到CAAACTCTCAACGATGGATGCCTCGGCTCGAGAATCGATGAAGGACGCAGCGAAGTGCGAT AAGCACTGCGATTTGCA FFON|FNH国。国华人民共国家标准派琴虫病诊断操作规程GB/T 26618-2011 和中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数15千字2011年8月第一次印刷开本880X12301/16 2011年8月第一版4峰15号:155066. 1-43368 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价GB/T 26618-2011 打印日期:2011年9月13日F002A
