1、ICS i i .020 c59 备案号:25526-2009引7中华人民共和国卫生行业标准ws 214-2008 代替ws214-2001 流行性乙型脑炎诊断标准Diagnostic criteria for J apanese encephalitis 2008-12-11发布2009-06-15实施咛1歪苦头、民主主王三奉1113三J3主全仨音IS发布目U吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。本标准代替并废止WS214-2001。本标准与V1S214-2001相比主要变化如下:一一增加了病原学、流行病学、鉴别诊断;-一修改了实验室检查部分i-一一删除了处理原则。本标准的附录A、附录
2、B为规范性附录，附录C、附录D为资料性附录。本标准由卫生部传染病标准专业委员会提出。本标准由中华人民共和国卫生部批准。ws 214-2008 本标准起草单位:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所、北京地坛医院、中国疾病预防控制中心免疫规划中心、解放军302医院。本标准主要起草人:梁国栋、李兴旺、陈园生、唐青、赵敏、蔡自告东。ws 214-2008 流行性乙型脑炎诊断标准1 范围本标准规定了流行性乙型脑炎的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。本标准适用于全国各级医疗卫生机构及其工作人员对流行性乙型脑炎的诊断、报告。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 流行性乙型脑炎Japanese
3、encephalitis ,JE 是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus , EV，简称乙脑病毒引起的，主要侵犯中枢神经系统的急性传染病，也称日本脑炎，简称乙脑，属自然疫源性疾病，主要经蚊媒传播，流行于夏秋季。2. 2 脑膜刺激征meningeal irritation si伊炎症剌激脊髓神经根，由其支配的相应肌群所出现的一种防御反应性肌痊孪现象。主要表现为颈强直、克尼格征CKernigssign)矛f布鲁辛斯基征JBrudzinskis sign)阳性等。3 诊断依据3. 1 流行病学史居住在乙脑流行地区且在蚊虫擎生季节发病，或发病前25d内在蚊虫擎生季节曾
4、去过乙脑流行地区。流行病学特征见附录D。3. 2 临床表现3.2. 1 潜伏期-般为10d-14d，可短至础，长至21do3. 2.2 临床症状急性起病，发热、头痛、喷射性呕吐，发热2d-3d后出现不同程度的意识障碍，重症患者可出现全身抽撞、强直性痊孪或瘫痪等中枢神经症状，严重病例出现中枢性呼吸衰竭。3 2. 3 体征浅反射消失、深反射亢进。脑膜剌激征和病理反射阳性、症孪性瘫痪或去大脑强直。可伴有瞌孔大小改变、血压升高、心率减慢等颅内压升高体征。3. 2. 4 临床分型3.2.4.1 轻型发热，体温一般不超过390C;头痛、呕吐、精神萎靡，神志清楚，无抽撞.病程7d，._lOd。3. 2. 4
5、, 2 普通型发热，体温390C，._，400C;剧烈头痛、喷射性呕吐、烦躁、嗜睡、昏睡或浅昏迷，局部肌肉小抽撞，病程约2周。3. 2. 4. 3 重型发热，体温400C以上;剧烈头痛、喷射性呕吐.很快进入昏迷，反复抽撞，病程约3周，愈后可留有y口遗症。ws 214-2008 3.2.4. 4 极重型起病急骤，体温在ld._，2d内上升至400C以上，反复或持续性强烈抽擂，伴深昏迷，迅速出现脑痛及呼吸衰竭.病死率高，幸存者发生后遗症几率较高。3. 3 实验室检查3.3. 1 血象白细胞总数多在(10._，20)X 109 /L，中性粒细胞可达80%以上。3. 3. 2 脑脊液压力增高，外观清亮
6、，白细胞计数增高，多在(50._，500) X 106 /L，早期以多核细胞增高为主，后期以单核细胞增高为主，蛋白轻度增高，糖与3. 3. 3 血清学检查操作方法按附录B进行，3.3.3. 1 1个月内未接种3.3.3.2 恢复期血清中上升高;3.3.4.2 检测4 诊断原则4.1 根据流行、4.2 确定诊断35 诊断5.1 疑以病例5.3 确诊病例临床诊断病例，同时乍5. 4 在临床诊断或确定诊6 鉴别诊断2 A.l 乙脑病毒分离A. 1.2 组织细胞培养法A. 1.2.1 试验材料C6/36、BHK-21、A. 1. 2. 1. 2 C6/36 a)生长液:10 和1000 b)维持液:1
7、l(j 10 000g A. 1.2.2 操作步呢A. 1.2.2.1 生长至种，血清需1: 2,._. 1 : A. 1. 2. 2. 2 1 h后弃去、养箱中继续培养;A. 1.2.2.3 显微镜下观察生A. 1.2.2.4 出现病变的细胞实验。A. 1.2.3 结果判定附录A(规范性附录)乙脑特异性病原学检测ws 214-2008 10mL、10000U/调液体pH7.2-、10000U/mL青pH 7. 27. 40 OOU/mL青霉素280C、5%二氧化碳培乙型脑炎病毒感染C6/36细胞后，细胞病变表现为细胞聚集，融合和脱落等特征。患者标本引起组织培养细胞出现病变并非诊断乙脑病毒感染
8、的特异性指标，还需要对分离物进行乙脑病毒特异性鉴定实验方能确诊。A. 1.3 新生乳鼠接种法A. 1.3. 1 试验材料a) 2d，._，3d龄乳鼠，每窝乳鼠为一组。b)血清或脑脊液标本可以直接用于乳鼠接种。A. 1.3 2 操作步骤3 ws 214-2008 A. 1.3.2.1 在每只乳鼠左(右)侧眼后角与耳前缘与颅中线构成的三角区中心，刺人2mm- 3mm , 注射血清或脑脊液0.02rnL;A. 1.3.2.2 乳鼠接种后从24h起，每8h观察一次，出现发病后改为每4h观察一次。接种24h内死亡的乳鼠视为非特异性死亡;A. 1.3.2.3 乳鼠濒死时收获鼠，脑组织，未发病的乳鼠继续观察
9、至14d;A. 1. 3. 2.4 制备鼠脑研磨液进行下一轮接种实验。按照上述方法在鼠脑内传代3次。可以引起乳鼠规律病变的标本进行乙脑病毒特异性鉴定实验。A. 1.3.3 结果要IJ定一般乳鼠接种乙脑病毒后60h左右开始发病，表现为拒乳、离群、蜷曲、抽擂、四肢强直等症状，随着时间的推移症状逐渐加重，多数乳鼠在72h死亡。患者标本引起乳鼠发病并非诊断乙脑病毒感染的特异性指标，还需要对分离物进行乙脑病毒特异性鉴定实验方能确诊。A.2 乙脑病毒特异性核酸检测lA. 2.1 原理基于常规RT-PCR原理，设计乙脑病毒特异性引物，对脑炎患者的标本进行乙脑病毒特异性核酸检测。阳性结果可以判定为乙脑病毒感染
10、。该方法比病毒分离更加敏感、快速，可直接作出诊断。A. 2. 2 试验材料A. 2. 2.1 待检患者标本血清、脑脊液和或)尸检脑组织均可。标本要求元菌采集，最好是一800C或液氮保存，冷链运输;A. 2. 2. 2 PCR扩增引物上游引物:PrMF C251-275) : 5-CgT TCT TCA AGT TTA CAg CAT TAg C-3，下游引物:PrMRC925-90 1) : S-CC YRT gTT YCT gCC AAg CAT CCA MCC-3; A.2.2.3 细胞总RNA分离试剂Trizol(用于组织标本); T rizol SLC用于液体标本)，或病毒RNA提取试
11、剂盒iA. 2. 2. 4 逆转录和PCR扩增试剂AMV逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPMi xture等。A. 2. 3 操作步骤A. 2. 3.1 病毒RNA提取待检标本用细胞总RNA分离试剂提取RNA，按照细胞总RNA分离试剂说明书操作;A.2.3.2 逆转录合成cDNA根据M叫V逆转录酶反应要求，按照说明书通过逆转录反应合成与目的基因即-JA序列互补的cDNA;A.2凰3.3PCR扩增目的基因的扩增条件为950C预变性5min，940C30s、550C30s、720C60s、扩增30-35个循环，720(延伸10min;A. 2.3.4 结果观察用1%-2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增
12、产物。A. 2. 4 结果判定该对引物对中国以往分离株及近年新分离的乙脑病毒均特异，应用以上引物扩增产物应为674核昔酸片断，如果扩增产物分子量与预期片段相同，而阴性对照元条带，表明标本中含有乙脑病毒核酸，可以判定为乙脑病毒核酸检测阳性。PCR产物的核昔酸序列还可以进行乙脑病毒基因分型研究，从而进二步揭示病毒株的基因型别特征。4 ws 214-2008 附录B(规范性附录)乙脑血清学检测B.1 微量中和试验(固定瘸毒-稀释血清法)B.1.1 原理人或动物感染乙脑病毒后，血清中可产生具有高度特异性的中和抗体。中和试验是利用观察病毒感染力而检测标本中乙脑病毒中和抗体水平的实验方法。其基本原理是先将
13、病毒与标本进行中和反应，然后接种组织培养细胞或实验动物来测定病毒感染力。观察病毒感染力的方法有细胞病变法、蚀斑形成法以及计算动物死亡数等。这里主要介绍用于检测患者血清标本中和抗体滴度的固定病毒稀释血洁的微量中和试验。B. 1.2 试验材料B. 1.2.1 待检血清标本:无菌采集，-20oC以下保存;B. 1. 2.2 细胞及相应培养液:按A.1. 2分离乙脑病毒iB. 1. 2. 3 元菌Hanks洗液，调至pH7.4; B. 1.2.4 仪器设备:倒置生物显微镜、3rC，5%CO2恒温培养箱、370C水浴锅、组织培养板及加样器、吸管等。B. 1.3 操作步骤B. 1.3. 1 TCIDso滴
14、定首先在敏感的细胞测定病毒50%致细胞病变量CTCI队。)以确定进行中和试验的病毒用量，一般使用100TCIDso/50L。允许范围为32r-.-320TCID3o0 B. 1. 3. 1. 1 将生长状态良好的组织培养细胞接种至无菌96孔板(100L/孔)，在3rc，5% CO2孵箱培养24h左右，观察细胞生长状态以进行TCIDso试验;B. 1.3.1 . 2 取新鲜病毒悬液，用维持液连续10倍系列稀释，每个稀释度换用一个新的吸管或吸头;B. 1. 3. 1. 3 稀释的病毒分别接种于组织培养细胞，96孔板接种量为50/.1L/子L;病毒每稀释度接种4孔，平行设立正常细胞对照4孔，370C
15、，5% CO2培养箱中吸附1h;B. 1. 3. 1. 4 取出细胞培养板，吸去病毒液，以Hanks液洗3次.补加100L细胞维持液将细胞管置于5%二氧化碳恒温培养箱中培养数日;B. 1. 3. 1. 5 逐日在显微镜下观察并记录细胞病变情况，一般连续观察3d，._，7d;B. 1. 3. 1.6 按Reed和Muench法计算该病毒液的TCID50。具体计算方法见式CB.1)和式出.2) : 高于50%细胞病变百分数-50距离比例=. 巳.1)高于50%Jffi!1W12s八血1-.I rt -r r n / l .rn nh止-=川且LTCIDso =高于50%病变的病毒最高稀释度的对数+
16、距离比例CB.2 ) 得到的计算结果可以表述为:在所计算得到的稀释度下，病毒的感染性剂量为1TCID5o/50Lo B. 1.3. 2 中和试验B. 1.3.2.1 细胞培养:将生长状态良好的组织培养细胞接种至无菌96孔板，5%COz孵箱培养24h左右，观察细胞生长状态以进行微量中和试验;B. ).3.2.2 血清标本的稀释:首先将待检血清在560C灭活30min;用维持液进行系列倍比稀释成1: 10、1: 20、1: 40等。具体操作步骤:取6，._10个无菌处理的离心管分别标记不同的稀释度;向第1管加入450L维持液，其余各管中加入100L维持液;取50L血清原液加入到第1管中，充分混匀，
17、换用新吸头吸取100L加入第2管?充分混匀并依次进行稀释;r-3 ws 214-2008 B. 1. 3. 2. 3 对照的设立:已知阳性对照血清8孔，设立1: 40 ,1 : 80两个滴度的阳性对照孔;以维持液为阴性对照，设立正常细胞对照4孔;血清对照4孔(待检血清十等体积维持液)，病毒感染对照4孔(病毒稀释液十等体积维持液)，病毒工作液滴度检查，(每孔中加入50L2倍系列稀释病毒液，最终第一孔为100TCIDso、50TCIDso、25TCIDso0.7TCIDso)。B. 1.3.2.4血清标本与病毒悬液的孵育:按照TCIDso试验测定的病毒原液进行适当稀释，得到100TCIDso /2
18、5L病毒稀释液，取病毒稀释液分别与稀释的待检血清、病毒对照、阳性血清对照等量混匀;37C水溶作用lh;B. 1.3.2.5 病毒接种:从细胞培养箱中取出96孔板，弃去细胞培养液，用Hanks液洗涤细胞孔板3次，动作应轻柔，弃去孔板内的液体，取iA卢蝉酥的丰屋舍睦相应细胞培养孔中，每个滴度样品平行高于50%病毒稀薄度10-1 10-2 10-3 10-4 10-0 10-.- 6 正常对照4 4 注:t所指方向为累加的方向。液放置于370C二氧化碳细胞培养箱数CB.3)系数的对数。中间距离比例按出现细胞病变率/%100 100 100 80 20 。能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4
19、-5 ，即TCID50为10-4-5 ，当病毒悬液做104.5倍稀释时，50L中含1个TCIDsoQ B. 1.4.2 中和试验结果计算方法举例如下:由表B.2可以看出50%细胞病变出现在血清稀释度的1: 320 ,._, 1 : 640之|司，其中间比例可以按式CB.5): 6 ws 214-2008 表B.2中和抗体滴定计算表(示意)病变观察CPE分布CPE累计血清稀释度19CPE孔数/总孔数阳性阴性阳性+I CPE比数ICPE百分比/%阴性1 : 10(10一1) 。/4。4 。24 。/24。1 : 20(10- 1.3) 0/ 4 。4 。20 。/20。1 : 40 (10-1.
20、6) 。/4。4 。16 。1 : 80 (1 0-1. 9) 0/4 。4 。12 。/12。1 : 160 (10 - 2. 2 ) 。/4。4 。8 。/8。1 : 320(10-2.5) /PfZ 田，j 鸟飞4 1/5 20 1 : 640 00-2.8) 3/ 民世p1 严-t4/ 5 80 : 1 280 (10-3.1) ，凡、j)!JIIIIIII . A 8/8 100 -2.65的反滴度判定为1: 为荔脑病毒感染。B. 2.1 原理乙型脑炎病如。由于乙脑的潜伏期为4d-21d，性IgM抗体。查至诊断为乙型脑炎。I本中抗乙脑病毒IgM有过氧化物酶的抗乙1B. 2. 2. 3
21、 B.2.2.4 过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体;B.2.2.5 包被液:O. 05mol/L! pH 9.6碳酸盐缓冲液;B.2.2.6 封闭液:含1%牛血清白蛋白(或5%脱脂奶)和O.05 % Tween-20的PBS液体;B. 2.2. 7 稀释液:含有0.5%牛血清白蛋白(或3%脱脂奶)和0.05% Tween-20的PBS液体;B. 2.2. 8 洗液:含有O.05 % Tween-20的PBS液体;B.2.2.9 底物液:OPD或Tr-.屈;B. 2. 2.10 终止液:4NH2S04j B. 2. 2. 11 酶标仪、洗板机、ELISA用96孔板、移液枪、多通道移液检、370C水
22、浴、湿盒。7 ws 214-2008 B. 2. 3 操作步骤B. 2.3.1 抗人IgM，链抗体用pH9. 6碳酸盐缓冲液稀释后包被，100上/孔，40C过夜，洗板3次，甩B. 2. 3. 2 每孔加200L封闭液，370C温浴约，洗板3次;B.2.3.3 加待测标本(血清或脑脊液)!并设立阳性对照、阴性对照和空白对照!100L/孔;B. 2. 3. 4 3rC温浴1h，洗板4次，甩干;B. 2. 3. 5 每孔加100L灭活抗原，370C温浴1h.洗板4次，甩干;B. 2. 3.6 加适当稀释后的乙脑单克隆抗体，100L/孔，370C温浴1h，洗板4次，甩干;. 2. 3. 7 加酶标抗鼠
23、IgG抗体，100L/孔，370C温浴1h，洗板4次，甩干iB.2. 3. 8 加底物液OPD或Tl钮，100L/孔，370C温箱避光孵育15mn;B. 2. 3.9 每孔加50L终止液，终止反应;B. 2. 3.10 酶标仪在490口m或450nm处测00值;B. 2. 3. 11 阳性对照:乙脑阳性血清或脑脊液代替待检标本，至少设立两孔，取平均值;B. 2. 3. 12 阴性对照:阴性血清或脑脊液代替待检标本，至少设立两孔，取平均值;. 2. 3.13 空白对照:稀释液代替待检标本。B. 2. 4 结果判定首先根据式。.6)P/N值，式中:Nj一一标本的OD值;No一空白对照的OD值iN2
24、一一阴性对照的OD值。P/j叫=(NJ八，To)/CN2-No). CB. 首先汁算阳性对照孔，阳性对照P/N二三2.1情况下说明实验成立。其他检测标本的结果判定如下:检测标本P/N二三2.1时、可以判定为阳性，表明患者新近感染乙脑病毒;当1.5P/N2. 1时，检测结果判为可疑阳性，需结合其他诊断方法的结果进行综合分析;当P/Nl.5时，结果判为阴性，提示标本中无抗乙脑病毒IgM抗体。B. 3 间接ELISA法检测抗乙脑病毒IgG抗体B. 3.1 原理利用包被在塑料板孔中乙脑病毒抗原可以特异性结合患者标本中抗乙脑病毒抗体，再通过酶标记的抗人IgG抗体结合人源IgG的特性，达到检测目的。一般用
25、乙脑全病毒作抗原，故检测到的不仅有乙脑中和抗体，还有乙脑非中和抗体。抗乙脑病毒IgG抗体阳性提示感染过乙脑病毒或接种过乙脑疫苗。B.3.2 试验材料B. 3. 2. 1 包被液、封闭液、洗液、底物液与终止液同B.2. 20 B.3.2.2 灭活抗原、过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。B.3.3 操作步骤B. 3. 3. 1 乙脑病毒抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释后包被，100L/孔，40C过夜，洗板3次，甩干iB.3.3.2 加封闭液，200L/孔，370C温浴泊，洗板3次;B. 3. 3. 3 加待检的血清，并设立阳性对照、阴性对照和空白对照，100L/孔，370C温浴lh，洗板4次iB.
26、3. 3.4 加酶标记抗人IgG抗体，100L/孔，370C温浴血，洗板4次;B. 3. 3. 5 加底物液OPD或TMB，10年L/孔，370C温箱避光孵育15min;B. 3. 3. 6 加终止液终止反应，50L/孔;8 B. 3.3.7 在490nm或450nm处检测OD值;B. 3. 4 结果要Ij定按式CB.6)计算P/N值。ws 214-2008 首先计算阳性对照孔，阳性对照P/八f二三2.1情况下说明实验成立。其他检测标本的结果判定如下:检测标本P/N二三2.1时.可以判定为阳性;当1.5P/N2. 1时，检测结果判为可疑阳性，需结合其他诊断方法的结果进行综合分析;当P/N?15
27、吨结果判为阴性。只有当双份血清中抗乙脑病毒肌抗体4倍或4倍以上升高才具有诊断意义。9 ws 214-2008 附录C(资料性附录)免瘟荧光法检测抗乙脑病毒抗体C. 1 间接免疫荧光试验(IFA)检测抗Z脑病毒I1:，IgG抗体C. 1.2 试验材料C. 1.2. 1 抗原片:用乙俨、C. 1. 2. 2 对照:乙脑mJiC. 1. 2. 3 C. 1.2.4 制)等;C. 1. 2. 5 C. 1. 2. 6 C. 1.3 操作步，C. 1.3.1 从冰晾干;C. 1. 3.2 滴加C. 1.3.3 湿盒C. 1.3.4 C. 1.3.5 对照孔); C. 1. 3. 6 C. 1.3.7 C
28、. 1.3.8 C. 1.3.9 .飞C. 1.3. 10 阴性对照:阴性C. 1.3. 11 空白对照:PBS液fC. 1.4 结果判定、90%甘油CPBS配遍，每次2min，ln，晾干;只有在阳性对照存在特异性荧光，百际情姗姗得了空白对照元荧光时，检测结果才是可靠的。急性期血清标本稀释度二三1: 10荧光阳性(脑脊液为二三1: 5)可以判定为抗乙脑病毒IgM抗体阳性;或双份血抗乙脑病毒IgG抗体4倍或4倍以上升高可以判定为阳性。10 D.1 病原学D. 1.1 分类附录D(资料性附录)乙脑的病原学与流行病学乙脑病毒(Japanese encephalitis virus , JEV: D. 1.2 形态结构乙脑病毒对常D. 1.5 诊断意义检测到乙脑、D.2 流行病学D. 2. 2 宿主及翩主主要传染源症，此时蚊虫吸血蚊虫既是本病D. 2.3 人群易感d人群对乙脑病毒品g状;感染后获得持久性店、D. 2. 4 流行病学特征乙脑发病以儿童为主，自治区、直辖市均有乙脑的流行陆千ws 214-2008 11
