1、ICS 07. 100 c 53 中华人民共和国国家标准GB 15193.6-2003 代替GB15193. 6 1994 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验2003-09-24发布Mammalian bone marrow cell chromosome aberration test 2004-05-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布49 GB 15193.6-2003 前言本标准全文强制a本标准代替GB15193. 6 1994骨髓细胞染色体畸变试验。本标准与GB15193. 6 1994相比的主要修改如下一一将标准名称“骨髓细胞染色体畸变试验”改为“哺乳动物骨髓细胞染
2、色体畸变试验”；一一在咱围吨增加了受试物的具体内容t食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；增加不适用范围；将原操作步骤中“5.1 动物处理”标题下的有关内容分列为：“试验动物”、“剂量及分组”和“操作步骤”三章；一一增加章题“试验动物”，将“取健康成年大、小鼠”改为“常用健康年轻的成年大鼠或小鼠”；一一增加章题“剂量及分组”，并将高剂量组的设计方法增加条“急性毒性试验给予受试
3、物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量求不出l.D时，高剂量组则按以下顺序：a)10 g/kg体重，bl人的可能摄入量的100倍；;il(c)一次最大灌胃剂量进行设计增加参考阳性对照物“丝裂霉素C1. 5 mg/kg体重2.0 mg/kg体重），或环磷酸胶（40mg/kg体重）”；将原“5.1. 2”剂量设计以外的内容放在增加的“操作步骤”标题下，并在此标题下增加“受试物配制”的有关内容；增加“结果判定”内容。自本标准实施之日起，Gil15193. 6 1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位2中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫
4、站。本标准主要起草人：韩驰、唐玲光、袁振华。本标准于1994年首次发布，本次为第次修订。50 GB 15193.6-2003 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验1 范围本标准规定了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的基本技术要求。中4标准适用于评价食品生产、加T、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、小鼠骨髓细胞的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（吉营养强化剂）、食品新资源且其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等本标准不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织（targettis
5、sue) 骨髓的情况，2 原理染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期GI期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大1J、鼠腹腔注入秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰在显微镜下现察染色体数日和形态。3 仪器与试剂告部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸倒水。3.1 0.1%秋企仙章，置于棕色瓶中，冰箱保存。3. 2 2. 2 %拧撵酸销。3. 3 pH 7. 4磷酸盐缓冲液3. 3. 1 1 I IS mol/L磷酸氢二饷溶液z磷酸氧二锅CNa,HP0,)9.4
6、7g溶于looo mL蒸馆水中。3.3.2 !/Jo mol/L磷酸工氢何溶液磷酸二氧怦CKH,PO,)49. 07 g溶于l000 mL蒸铺在中。3.3.3 将磷酸氢二铀溶液80ml，与磷酸二氧御溶液20mL 混合，用pHt十测定并调节pl！至7.4 3. 4 0. 075 mol/L氯化御溶液。3.5 甲醇（分析纯）冰乙酸（分析纯以3 1混合，临用时现配。3. 6 (;iemsa榕液。3. 6. 1 Giemsa储备液：取Giemsa染料3.8 g，置玛瑶乳钵中，加少量甲醉研磨逐渐加甲醇至375mL. 溶解后再加125ml纯甘油，于37温箱保温48h.在此期间摇动数次放置l周2周过滤备用。
7、3. 6. 2 Giemsa应用液取1mL储备横加人10n1L pH 7. 4磷酸缓冲液。3. 7 仪器与设备：实验室常用设备、恒温水r!t锅（37士5）、离心机、生物显微镜。4 实验动物常用健康年轻的成年大鼠或小鼠每组用两种性别的动物至少各5只。动物购买肝适应环境至少3天a5 剂量及分组受试物应设三个剂暨组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和或个别动物出现死亡的剂量般可取1/2LD川低剂量组应不表现出毒伸，分别取I/4和1/8LDoo作为中、低剂量。急性毒性试验给于受试物昼大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物元死亡而求不出LD”时，高剂量组则按以5; GB 15193.6-2003
8、 下顺序za) 10 g/kg体重；b)人的可能摄入量的100倍；或c)一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性物可用丝裂霉素C(l.5 mg/kg体重2.0 mg/kg 体重）或环磷酸胶（40mg/kg体重）经口或腹腔注射（首选经口给予。6 操作步骤6. 1 受试物配制一般用蒸馆水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、竣甲基纤维素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等）保存具有稳定性。6.2 实验动物的处理经口给予受试物2次4次，每次间隔24h，在末次给受试物后18h 24 h取材。必要时可先用一
9、个剂量的3只动物，于给受试物后6、24、48h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6、24、48h后分别各处死5只动物取材。处死动物前2h 4 h，按4mg/kg体重腹腔注入秋水仙素。大鼠断头处死，小鼠颈椎脱日。6.3 标本制备6. 3. 1 取材取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨儒，用带针头的注射器吸取2mL 4 mL 2. 2%拧橡酸纳溶液，将骨髓洗人10mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000 r/min 1 500 r/min离心10min，弃去上清液。6. 3.2 制片离心后的沉淀物加入4mLO.。75mo
10、l/L氯化饵溶液，混匀后在37水浴或恒温箱中放置10min 20 min，再以1000 r/min 1 500 r/min离心，弃去上清液。将新配制的甲醇冰乙酸固定液4mL沿管壁加入受试物中，10min 15 min后，用吸管将细胞团块打碎继续固定10min 15 min，以1000 r /min离心10min弃去上清液，再加固定液4mL静置20 min后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5 ml,1. 0 ml，细胞悬液。先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。自冰水中取出载玻片，倾斜30放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制2张3张玻片，空气中自
11、然干燥。临用时取Giemsa储备液1mL，磷酸盐缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15min 左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。6.4 阅片6. 4. 1 阅片要求在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。6.4.2 观察项目6.4.2.1 染色体数目的改变6.4.2.1.l 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。6.4.2.1.2 多倍体：染色体成倍增加。6.4.2.1.3 内复
12、制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。6.4.2.2 染色体结构的改变6.4.2.2.1 断裂损伤长度大于染色体的宽度。6.4.2.2.2 微小体2较断片小而呈圆形。6.4.2.2.3 有着丝点环3带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。52 6.4.2.2.4 元着丝点环2成环状结构。6.4.2.2.5 单体互换形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。6.4.2.2.6 双微小体z成对的染色质小体。6.4.2.2. 7 裂隙z损伤的长度小于染色单体的宽度。6.4.2.2.8 非特定性型变化z如粉碎化、着丝店、细长化、粘着等。7 数据处理统计学处理用X检验。8 结果判定GB 15193. 6-2003 试验组与对照组相比，试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著位，但无剂量反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。53
