1、GB/T 14926.1994 1 主题内容与适用范围 本标准规定了流行性出血热病毒（以下简称EHF）的检验方法、试剂等，适用于检测大、小鼠的EHF感染情况。 2 引用标准 GBT 14926.18 实验动物 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检验方法 3 材料和试剂 3.1 EHF 毒种：76118。 3.2 VeroE6传代细胞。 3.3 EHF 的单克隆抗体（以下简称McAb）标记荧光素结合物。 3.4 抗大鼠IgG标记辣根过氧化物酶结合物。 3.5 抗小鼠IgG标记辣根过氧化物酶结合物。或葡萄球菌蛋白A（以下简称SPA）标记辣根过氧化物酶结合物。 3.6 冷冻切片机。 3.7 荧光显微镜。 3
2、.8 酶标仪。 4 检验步骤 4.1 制备抗原片：76118病毒感染E6细胞，每23天更换维持液，培养710天，用IFA法预测细胞内特异性荧光，当荧光达时，在负压净化台上将细胞用胰酶分散，用磷酸盐缓冲液PBS洗涤，涂片，吹干，冷丙酮固定，吹风时为保证安全应同时用紫外光照射。 4.2 制备ELISA抗原：当预测被76118感染的E6细胞特异性荧光达时，即可收获培养物，浓缩纯化处理抗原，首先要培养出高滴度的病毒液，并经过高速离心和梯度离心纯化，或者浓缩包被高效价的EHF McAb，再和粗提的EHF抗原结合，使结合上的抗原达到较高特异性，再检查血清样品。 4.3 制备EHF抗血清： 4.3.1 EH
3、F McAb25-1。 4.3.2 EHF免疫用抗原用 -丙内酯灭活再免疫动物。 4.4 EHF阴性血清：采集无EHF病毒感染的大小鼠血清作为阴性血清。 5 检测方法和结果判定 5.1 测EHF病毒抗原：直接IFA法，适用于检测大、小鼠的肺脏，用冷冻切片机将肺脏切成4页码，1/2GBT 14926.19942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92619R.htm5m薄片，丙酮固定在玻片上，用已知EHF抗体标记荧光素结合物工作浓度和伊文思兰一起混合，37水浴孵育40min。 5.2 直接ELISA法查抗原，方法见GBT 14926.18中4.1.6。
4、5.3 测EHF病毒抗体。 有直接法和间接法两种。 5.3.1 免疫荧光直接阻断试验法 将待检血清加到已知EHF病毒株的细胞抗原片上，37孵育45min，PBS振荡洗涤3次，吹干。加伊文思兰PBS稀释的25-McAb-FITC结合物。再孵育30min，同上法洗涤，蒸馏水漂洗后，吹干，封片，镜检。 5.3.2 免疫荧光间接阻断试验法 将待检血清加到已知EHF病毒株细胞抗原片上，再加25-McAb，最后加羊抗小鼠IgG荧光素结合物，孵育和洗涤方法同前。 当检样出现阳性时，选用同一种方法或另一种方法重试，如为阳性可判为阳性结果。 6 结果报告 根据判定结果，作出报告。 页码，2/2GBT 14926.19942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92619R.htm
