1、GB/T 14926.2494 1 主题内容与适用范围 本标准规定了小鼠肺炎病毒（以下简称PVM）的检验方法、试剂等，适用于检测实验小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠的PVM的感染情况。 2 引用标准 GB/T 14926.18 实验动物 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检验方法 3 材料和试剂 3.1 PVM毒种。 3.2 BHK21传代细胞。 3.3 酶标仪。 3.4 荧光显微镜。 4 检验步骤 4.1 制备ELISA抗原：PVM感染小鼠待发病后取肺脏，研磨，制成10悬液，3000r/min离心10min，取上清液感染已生长成单层的BHK21细胞，吸附1.52h，加维持液培养911天，当细胞病变（CPE）达
2、到时收获，浓缩提纯方法见 GB/T 14926.18中4.1.2.2。 4.2 制备IFA，IEA抗原片：PVM感染BHK21或Vero细胞，当CPE达时，将细胞用胰酶分散，洗涤后，用PBS悬浮，滴片。滴片方法，抗原的鉴定和保存见 GB/T 14926.18中4.2.3。 4.3 制备PVM阳性血清：用PVM病毒抗原免疫SPF小鼠。 4.4 制备PVM阴性血清：采集无PVM病毒感染的小鼠血清，作为阴性血清。 5 检验方法和结果判定 5.1 ELISA法，见GBT 14926.18中4.1。 5.2 IFA法和IEA法见GBT 14926.18中4.2。 5.3 血球凝集抑制试验（HI） 5.3
3、.1 材料、设备和试剂 5.3.1.1 恒温培养箱。 5.3.1.2 冰箱。 5.3.1.3 微量震荡器。 5.3.1.4 微量血凝反应板（u型）。 页码，1/3GB/T 14926.24942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92624R.htm5.3.1.5 微量加样器。 5.3.1.6 血凝抗原：血凝抗原除部分病毒（如痘类病毒）能与感染性颗粒分开外，大部分是与病毒的感染性颗粒相关联，凡培养于鸡胚或组织培养中的病毒及其抗原物质，经离心除去沉淀，均可用作血凝抗原或血凝抑制试验的抗原。 5.3.1.7 红血球悬液：根据不同病毒血凝所需敏感红血球制备悬
4、液，一般将血液保存于阿氏溶液内，用前以pH7.2磷酸缓冲盐水洗三次，再悬于pH7.2磷酸缓冲盐水内。 5.3.1.8 阿氏溶液配制法 葡萄糖 2.05g 枸橼酸钠 0.8g 氯化钠 0.42g 蒸馏水 100mL 以上药品混合后加热溶化，115 30min灭菌，保存于4。 5.3.2 检验程序 5.3.3 操作步骤 5.3.3.1 血凝素滴定：将病毒液用磷酸缓冲盐水（PBS）倍比稀释成不同浓度，每稀释度留0.025mL于微量血凝板孔内，再加0.025mLPBS与0.05mL红血球悬液，摇匀，置4或所需温度1h，判定结果时将出现血凝“”的最高稀释度病毒定为一单位血凝素（作血凝抑制试验当天，先将血
5、凝素效价测定好）。 5.3.3.2 待检血清处理：将被检血清置56水浴30min，有的血清含有非特异性抑制素，可用霍乱滤液处理，即1份血清加4份滤液，混匀后置37水浴过夜，再置56水浴30min，有的血清含有非特异性凝集素，可按血清体积1/10量加入50红血球悬液置416h或室温2h，然后离心除去血球。 血凝抑制试验待检血清处理血清稀释（作血清对照）加816单位血凝素（校对血凝素单位）摇匀置22或所需温度作用 30min加红血球悬液（作血球对照）摇匀置4或所需1h判定血凝抑制效价页码，2/3GB/T 14926.24942006-3-30file:/C:Inetpubwwwrootdatagb
6、bBE92624R.htm5.3.3.3 血清稀释：自110起作一系列倍比稀释，每稀释度留0.025mL于血凝板孔内，另取110血清0.025mL作血清对照（不加抗原，只加PBS0.025mL）。 5.3.3.4 滴加病毒：于已稀释好的血清孔内（除血清对照孔外）加0.025mL病毒（8或16单位血凝素），摇匀置22或所需温度作用30min。 5.3.3.5 血凝毒单位校对：滴加病毒的同时，将8单位血凝素稀释成4单位、2单位、1单位与1/2单位，每孔0.025mL病毒，加0.025mLPBS。 5.3.3.6 血球对照：加PBS0.05mL。 5.3.3.7 滴加红血球悬液：全部试验和对照孔内，
7、均加0.050mL红血球悬液，摇匀置4或所需温度1h判定结果。 5.3.3.8 结果判定：判定时以完全不出现血凝的血清最高稀释度为血清的血凝抑制滴度。 各孔血凝结果以 表示。 ：红血球一片凝集，均匀铺于孔底。 ：红血球凝集基本同上，孔底有大圈。 ：红血球于孔底形成一个中等大的圈，四周有小凝块。 ：红血球于孔底形成一个小圈，四周有少许凝块。 ：红血球完全不凝集，沉于孔底。 6 结果判定 当检样出现阳性时，选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性则判为阳性结果。 7 结果报告 根据判定结果，作出报告。 页码，3/3GB/T 14926.24942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92624R.htm
