1、GBT 14926.894 1 主题内容与适用范围 本标准规定了实验动物肺支原体的检验方法。适用于小鼠、大鼠的肺支原体检验。 2 材料和试剂 2.1 支原体液体培基 2.1.1 成分： 2.1.2 方法：将上述成分混合后，分装无菌小试管，每管2mL，4保存。 2.2 支原体半固体培基 2.2.1 成分： 2.2.2 方法：马丁氏半固体培养基放水浴中煮沸至溶化，待培养基冷至60左右，加入酵母浸液、马血清、青霉素（初代分离时加醋酸铊），摇匀，待培养基冷至3740时接种标本。 2.3 支原体固体培基 2.3.1 成分： 2.3.2 方法：马丁氏固体培养基放水中煮沸溶化，待培养基冷至60左右加入酵母浸
2、液、马血清、青霉素添加液、醋酸铊添加液摇匀。倾注平皿（直径为6cm）倾注量约78mL。 2.4 无菌马血清 马丁氏液体培养基 7mL健马血清 2mL酵母浸液 1mL青霉素添加液 0.5mL醋酸铊添加液 0.25mL马丁氏半固体培养基 7mL健马血清 2mL酵母浸液 1mL青霉素添加液 0.5mL醋酸铊添加液 0.25mL马丁氏固体培养基 35mL健马血清 10mL酵母浸液 5mL青霉素添加液 2.5mL醋酸铊添加液 1.0mL页码，1/4GB/T 14926.8942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92608K.htm2.5 无菌酵母浸液 2.5.
3、1 成分： 2.5.2 方法： 鲜酵母500g，加入1500mL双蒸水中，边加边搅拌，使之充分溶解（用大烧杯），然后8090水浴2030min，不停摇动。冷却，70008000转离心20min。 取上清以1N NaOH调pH为7.88.0，然后置9095水浴15min（边摇动）。冷却，再以70008000 转离心20min，取上清，蔡氏滤器过滤（220nm膜除菌过滤），分装20保存备用。 2.6 醋酸亚铊添加液 2.6.1 成分： 2.6.2 方法：称取醋酸亚铊1g溶于100mL双蒸水中，滤器过滤，分装小管，4保存。 2.7 青霉素添加液 2.7.1 成分： 2.7.2 方法：青霉素100万单
4、位，以无菌手续吸取无菌蒸馏水（或注射用水）溶解，最后补足总液量为100mL，分装小试管20保存。 2.8 肺支原体抗血清 2.9 支原体染色液 2.9.1 Dienes 染色液配制 2.9.2 染色方法 鲜酵母 500g双蒸水 1500mL1N NaOH 醋酸亚铊 1g蒸馏水 100mL青霉素（钾盐或钠盐） 100万单位灭菌蒸馏水 100mL美蓝 2.5g天青（Azure） 1.25g麦芽糖 10.0g苯甲酸 0.2g蒸馏水 100mL页码，2/4GB/T 14926.8942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92608K.htm 将Dienes 染
5、色液用蒸馏水稀释300倍，滴加到平皿中，使其铺满整个平皿，不断摇动。15min后吸出染色液，用pH7.4PBS洗三次。平皿置于解剖镜或低倍显微镜下观察，支原体菌落被染成蓝色，L型细菌菌落在短时间内能染上蓝色，但经1530min后，由于细菌的新陈代谢作用把美蓝还原成无色，而支原体则长时间保持其染色。 3 检验程序 4 操作步骤 4.1 标本采集 取动物气管中段放入装有0.5mL酵母浸液的试管中，充分吹打或振摇，制成洗脱液。或取动物生殖道、尿道、中耳和病变组织，制成洗脱液。 4.2 分离培养 将冷至50的支原体半固体基础分装中试管，每管3.5mL。再加入无菌马血清1mL，青霉素添加液0.25mL，
6、醋酸亚铊添加液0.1mL及0.5mL洗脱液。混匀后置361，5CO2培养箱或加胶塞厌氧培养。对初代培养阴性者应于培养7天后盲传半固体培基，共传两次。如仍无可疑菌落出现，可报告阴性结果。 4.3 鉴定 4.3.1 待半固体培基中出现“沙粒状”或“彗星状”菌落时，转种液体培基，进行纯培养。 4.3.2 各取0.1mL培养液涂于2块支原体固体平皿，待平皿表面稍干后，其中1块放入浸有肺支页码，3/4GB/T 14926.8942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92608K.htm原体抗体的滤纸片（ 6mm）作生长抑制，另一块作菌落观察。平皿放3615CO2或密封塑料袋中培养35天后观察。滤纸片周围有明显抑制带者表明生长抑制试验阳性。用放大镜或低倍显微镜观察支原体在固体培基上的菌落形态呈“煎蛋状”或“杨梅状”。支原体在固体培基上的形态受琼脂浓度及质量的影响较大，必要时做支原体染色，以区别支原体和L型细菌。 5 结果报告 凡生长抑制试验阳性者，可报告肺支原体阳性。否则，可报告支原体培养阳性。 页码，4/4GB/T 14926.8942006-3-30file:/C:InetpubwwwrootdatagbbBE92608K.htm
