1、GB/T 18653-2002 前言本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量试验，证实该方法准确可靠。本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位2天津动植物检疫局。本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波。227 中华人民共和国国家标准胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法GB/T 8653-2002 Methods for isolation and identification of campylobactor fetus 1 范围本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离
2、鉴定方法。本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用。2 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定2. , 设备和材料2. ,. , 混合气体质量比为3.5%氧(02)、10%二氧化碳(C02J、86.5%氮(N，归。2. .2 厌氧培养罐。2. ,. 3 采样棒及吸球。2.4 2mL注射器.5号针头.20号针头。2. ,. 5 灭菌青霉素瓶及生理盐水，2. .6 供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。2.2 培养基和试剂见附录A(标准的附录)J。2.2. , 增菌运输培养基(TEM)。2.2.2 半脱氨酸牛心浸膏培养基(CHJ。2.2.3 琼脂培养基(MH)。2.2.4 疏基乙酸盐肉
3、汤。2.2.5 相关生化试剂。2.3 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图。2.4 分离培养2. 4. , 样品采集2.4. 母牛站立或六桂栏保定，用5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插入阴道，压扇另一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插入盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次，再将采样棒放入消毒液中。2.4.2 公牛六位栏保定，用绳子固定采祥侧的后肢，剪短阴筒外部的阴毛，用5%的来苏儿消毒公牛的尿道口，将采样棒的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压肩并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅速插入盛有3时，灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。2.4.3 样品液静置
4、1min-Z min，用灭菌注射器吸取上清液2mL，分别注入两瓶增菌运输培养基(见附录A中A1J中，每瓶1mL。振荡混匀，尽快送至实验室。2.4.4 取样品傲革兰民染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子蘸取样品液直接涂布于含抗菌素的MH(见附录A中A3)或CH(见附录A中AZ)琼脂平板上。2.4.2 已接种样品的增菌运输培养基置37C培养72h。用直径3mm的接种环将增菌液分别划线于两个MH或CH平板培养基上，将平板放置厌氧培养罐中，将罐内空气抽出，达到一5.5kPa时停止.充中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局2002-02-9批准2002-050实施228 GB/T 18653-. 2002
5、人经o.22m滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充入反复两次。将培养罐在37C培养72 h。以后胎儿弯曲轩菌均需在混合气体条件下培养。2.4.3 观察MH、CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可弃之。如有，将典型或可疑菌落划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72人胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径为1mm左右。2. 5 鉴定2. 5. 1 筛选试验2.5.1.1 取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂配方见附录A中A5、A6)。胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或S状，一
6、些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形成芽胞和英膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性。2.5.1.2 纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。2.5.2 生化试验2.5.2.1 将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验。表1胎儿弯曲杆菌生化反应菌名25 C I 42 C 1%甘I1%胆氨酸|汁3.5%氯药敏试验一一-，一荼睫嗣酸30g/片酶验化试氧酸解量尿水HU马铀t酶试验咀U川验剧创试生长试验卡+ 十+ 十R s 寸+ + + R 5 + 注十阳性反应; 阴性反应，土反应不定;R 拮抗;S 敏感2.5.2.2 所有生化试验管均于
7、混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖放松。2.5.2.3 生长试验g纯培养后的菌接种到2管疏基乙酸肉汤(见附录A中A4)中，分别放43.C和25C 温箱培养72h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。2.5.2.4 硫化氢CH2S)试验:纯培养后的可疑菌种接种于琉基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长宽为20 mmX6 mm的乙酸铅滤纸，观察3d4 d.:!m见滤纸变黑即为产生H2S之证。2.5.2.5 甘氨酸、氯化纳、胆汁生长试验:可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.5%氯化纳、1%胆汁生长的琉基乙酸肉汤中.37C培养72h.培养基近表面有云雾状生长为阳性。2.
8、5.2.6 药物敏感试验2用钳金耳挑取可疑菌落放于1mL灭菌生理盐水试管中，菌液浓度约为3X10个/m!.用灭菌l棉拭子蘸取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上，然后用镀子把含有30问荼院酬酸和头子包霉素的滤纸片贴在MH血平板上，在混合气体中37C培养24h72 h.量溶菌区，世二三18mm为敏感.14mm为不敏感。229 GB/T 18653-2002 2.5.2.7 马尿酸纳水解试验z取48h-72 h培养物接种于0.4mLl%马尿酸纳液(见附录A中A7.1)中制成浓厚菌悬液35C-37C水浴2h，再加入0.2mL苟三嗣试剂(见附录A中A7.2l，混匀后水浴20 min观察结果，变深紫色为阳性，淡
9、紫色或不变色为阴性。可用18h-24 h变形杆菌培养物作阳性对!照。2. 5. 3 结果判定根据2.5. 1和2.5.2的结果进行。2.5.3.1 凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌。2.5.3.2 过氧化氢酶试验、H，S试验、1%胆汁生长试验、3.5%氯化销生长试验和马尿酸水解试验，其中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性，均判定为非胎儿弯曲杆菌。2.6 报告结果的表示2.6.1 阳性结果:发现胎儿弯曲杆菌、发现胎儿弯曲抨菌胎儿亚种或发现胎儿弯曲杆菌性病亚种。2.6.2 阴性结果:未发现胎儿弯曲杆菌气230 GB/T 18653-2002 附录A(标准的附录)培养基和试
10、剂A1 增菌运输培养基(transportenrichment medium , TEM) 成牛血清1 000 mL 5氟尿嗜咣0.3 g 放线菌酣O. 1 g 茶院副酸3 mg 多粘菌素B100 000 IU 1%煌绿5 mL 将各种成分无菌操作加入到成牛血清中，充分混合后分装于20mL带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶中，每瓶8mL，然后水浴或在蒸气中加热2min-3 min(无压力)，使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将血清凝块捣碎。最后元菌操作充入混合气体3.5%氧气(02)，10%二氧化碳(C02)，86.5%氮气(风门。将和j备好的TEM培养基保存在4C冰箱中，可使用4个月。A2 CH培养基(
11、cysteineheart hlood agar) (含抗菌素)牛心浸液(或牛心粉30日)500 g 膜蛋白陈10 g 右旋糖10 g 氯化饷5 g L半脱氨酸1 g 琼脂12 g 蒸馈水1 000 mL pH6. 9-7. 0 加热溶解各成分后107.9kPa高压15mio，培养基冷却至50C-55C时，无菌加入:多粘菌素B2 mg 新生霉素2 mg 放线茵酣绵羊血混匀，倾注平板。放4C水箱备用。A3 MH培养基(muellerhinton agar) (食抗菌素)牛肉浸膏酷蛋臼水解物淀粉势;脂蒸馆水pH7.4士O.2 20 mg 100 mL 5 g 17.5 g 1. 5 g 15 g
12、1 000 mL 各成分加热溶解，107.9kPa高压15min，冷却至50C-55C时，无菌加入2杆商肤25 000 IU 231 GB/T 18653一-2002放线菌罔多粘菌素B新生霉素绵羊血i昆匀，倾注平板。4C冰箱保存。A4 疏基乙酸盐肉汤L胧氨酸氯化纳右旋糖酵母浸膏酷蛋白膜消化物(PancreaticDigest of Casein) 统基乙酸纳蒸馆水50 mg 1万IU5 mg 50 mL100 mL 0.5 mg 2.5 mg 5.5 g 5.0 g 15.0 g 0.5 g 1000 mL 加热至溶解，调整pH7.2土0.2.5mL试管分装.107.9kPa高压灭菌15min
13、o 新制备的培养基(AlA4)均应做元菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的质量。A5 氧化酶试J1%盐酸二甲苯对苯二胶水溶液，置棕色瓶中现用现配.-10C保存，有效期一周。用于氧化酶试验。A6 3%过氧化氢(H，)30%H20 , 蒸馆水装于棕色瓶中，有效期为周。用于触酶试验。A7 马尿酸盐水解试验A 7. 1 1 %马尿酸销马尿酸纳蒸馆水A7.2 水合苟二嗣苟三酣丙酣T嗣232 10 mL 90 mL 1 g 100 mL 3.5 g 50 mL 50 mL GB/T 18653 2002 附录B(提示的附录)胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图吉抗菌章MH样品革兰民血色或或CH培养摹捏醋片镜植TEM 增菌运输培#基37C 72h(浪合气争不舍抗菌噩MH或CH螃葬基图BI233
