1、ICS 11220B 41 囝嚣中华人民共和国国家标准GBT 22333-2008日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法Reverse transcription polymerase chain reaction forJapanese B encephalitis virus200808-22发布 200812-01实施宰瞀徽紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1。刖 置本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。本标准主要起草人：王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊、田克恭。GBT 2233
2、3-2008日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法GBT 22333-20081范围本标准规定了日本乙型脑炎病毒核酸的反转录聚合酶链反应试验的技术要求。本标准适用于动物脑组织中日本乙型脑炎病毒核酸的检测。2试剂21变性液(见第A1章)。22 2 molL乙酸钠溶液(pH40)。23酚一三氯甲烷一异戊醇混合液(见第Az章)。24 25 mmolL dNTP。25 8 mmolL上下游引物混合液(引物序列见第A3章)。26 10倍PCR缓冲液。27 1溴化乙锭(EB)溶液。28 TAE电泳缓冲液。29 1琼脂糖凝胶。210上样缓冲液(见第A4章)。211其他试剂：10 UuL AMV反转录酶、
3、100bp DNA分子质量标准物、50 UuL RNA酶抑制剂、5 UuLTaq DNA聚合酶、异丙醇、75乙醇溶液、25 mmolL氯化镁溶液、DEPC处理过的无菌双蒸水。3实验室条件31实验室级别要求实验室必须为生物安全级(BSL-3级)实验室。32实验室分区RT-PCR试验区域分反应液配制区(配液区)、核酸提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区一核酸提取区一扩增区一电泳区。严禁器材和试剂倒流。33实验室应配备的仪器及耗材331仪器：分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分析仪)、液氮罐或一70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20冰箱、水浴锅、
4、可调移液器(最大量程分别为2 pL、20 pL、200 pL、1 000 uL)。332 耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、10 mL一次性注射器、1I 5 mL灭菌离心管、02 mL薄壁PCR管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头(10zL、200 PL、1 000 uL)、灭菌双蒸水。4操作程序41样品的采集及处理411样品的采集：濒死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织。412样品的处理：每份样品分别处理。1GBT 22333-20084121组织样品处理：取待检脑组织病料约005 g置研磨器中剪碎并研磨，加入400 pL变性液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清200 pL，置1
5、5 mL灭菌离心管中，加入200 pL变性液，混匀。4122阳性对照处理：取日本乙型脑炎病毒弱毒疫苗200 pL，置15mL灭菌离心管中，加X200 pL变性液，混匀。4123阴性对照处理：取健康猪血清200 pL，置15 mL灭菌离心管中，加入200 pL变性液，混匀。42病毒RNA的提取421取已处理的待检样品及阴性、阳性对照样品，每管依次加入乙酸钠溶液30 pL、酚一三氯甲烷一异戊醇混合液300 pL，颠倒10次混匀，冰浴15 min，413 0009离心15 min。422取上清300 pL置于新的经DEPC水处理过的15 mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3 min或
6、一70冰箱中30 rain。取出样品管，室温融化，将离心管开口侧朝离心机转轴方向放入离心机内，420 0009离心20 min。423弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入一20预冷的75乙醇1 mL，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1 rain，真空抽干15 min。424用10 pL无RNA酶的灭菌双蒸水和1 pL RNA酶抑制剂沿离心管开口侧相反方向溶解沉淀。20储存备用。43 RT-PCR反应液组成(总体积25 FL)DEPC水 138 pL25 mmolL dNTP 25 uL8 mmolL上下游引物混合液 15 pL25 mmolL氯化镁溶液 12 pL10倍PCR缓冲液
7、 25 pLAMV反转录酶02“LRNA酶抑制剂03“L5 UL Taq DNA聚合酶 1 pL提取的RNA 2 pL44 RT-PCR反应程序4245 rain，953min；扩增条件为9530 S，5040 S，7240 S，35个循环后，72延伸10min。45电泳将PCR扩增产物15 pL与3 pL上样缓冲液混合，加样于1琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入100bp DNA分子质量标准物，以5 Vcm电压电泳40 min，用紫外凝胶成像仪观察结果。5结果判定当阳性对照出现375bp扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现375bp扩增带为日本乙型脑炎病毒阳性，
8、未出现相应扩增带的样品判为阴性。A1变性液柠檬酸钠十二烷基肌氨酸钠p巯基乙醇异硫氰酸胍灭菌双蒸水附录A(规范性附录)试剂的配制o764 go5 go868mL7418 g加至100mLA2酚一三氯甲烷一异戊醇混合液酸性酚三氯甲烷异戊醇A3引物序列上游引物P。下游引物P。A4上样缓冲液50 mL49 mL1 mL5 7一CAT TCC AAG CGA AGC AGG AGA TCC一35 s_GAC GTC CAA TGT TGG TTT GTC G一3GBT 22333-2008溴酚蓝02 g，加双蒸水10mL过夜溶解。50 g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100 mL。
