1、ICS 11220B 41 a雪中华人民共和国国家标准GBT 229 1 62008水泡性口炎病毒荧光RTPCR检测方法Protocol of fluorogenic RTPCR for vesicular stomatitis virus2008-12-31发布 20090501实施丰瞀徽鬻瓣警雠赞星发布中国国家标准化管理委员会“”刖 置GBT 229 1 62008本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)(第5版)。本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标
2、准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：花群义、周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军、张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁。1范围水泡性口炎病毒荧光RTPCR检测方法本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测。2缩略语下列缩略语适用于本标准。21荧光RT-PCR荧光反转录一聚合酶链反应。22 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。23 RNA核糖核酸。24 DEPC焦碳酸磷酯。25 PBS磷酸盐缓冲盐水(配方见附录A)。26 Taq酶TaqDNA聚合酶。27
3、 VSV水泡性口炎病毒。3原理GBT 229 1 62008水泡性口炎病毒属RNA病毒，根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。通过严格设计和筛选的引物和探针，涵盖水泡性口炎病毒的两个型和突变株，为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针。探针的5端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团；3端标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5 7端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团。在扩增时，Taq酶发挥它的5一3端外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液
4、中，仪器检测到发出的荧光信号。4材料与试剂41仪器与器材411荧光RTPCR检测仪。412高速台式冷冻离心机(离心速度12 000 rrain以上)。413台式离心机(离心速度3 000 rmin)。414混匀器。415冰箱(28和一20两种)。416微量可调移液器(5 vL，10 vL，100“L，1 000 pL)及配套带滤芯吸头。】GBT 229162008417 Eppendorf管(15 mL)、透明薄壁PCR管(o2 mL)。42试剂421 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。422三氯甲烷。423异丙醇：一
5、20预冷。424 PBS：配方见附录A。425 75乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20预冷。426水泡性口炎病毒荧光RTPCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项参见附录B。427 引物：上游引物为5 7 ATGGCTccTAcAGTTAAGAGAATCA_3，下游引物为5-TGAAGTAATCAGCCGGGTATTC3。428荧光双标记探针(10 vmolL)：(FAM)5-CGAAATTACCGGCCA AcGAGGATc_3 7(TAMAR)。扩增目标片段长度为97 bp。5抽样51采样工具511下列采样工具应经121土2，15rain高压灭菌并烘干。512棉拭子。513剪
6、刀、镊子。514注射器。515 15 mL EppendoH管。516研钵。52样品采集521 采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织、水泡液、血液、口腔分泌物和组织。采集后立即冷藏送检或放入含抗生素的PBS缓冲液中于4环境中保藏。编号并作好记录。522水泡液及水泡皮：只有当水泡完整时才能采集到水泡液。水泡一旦出现很快就会破溃，所以要不失时机地采集水泡液。首先用75酒精轻轻消毒水泡表皮，尽量去掉污物，用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中。523水泡液采取后，将水泡皮以无菌术剪下，放人含抗生素的PBS缓冲液中。若水泡已经破溃，则只能采
7、集破溃的水泡皮，用灭菌生理盐水涮洗掉水泡皮上的污物，放人上述缓冲液中。524口腔分泌物和咽喉拭子：用拭子采取VI腔分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次5次取分泌液，拭子一并放人盛有10mL含抗生素的PBS缓冲液的15mL Eppendor管中。也可用食道探杯刮取咽喉液体，放人加有抗生素的PBS中。编号，冷藏送检或低温保藏。525血液：用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中，密封、编号后保存于4环境中送检。526肌肉或组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，冷藏送检或低温保藏。53样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放人一个塑料
8、袋内)，于保温箱中加冰、密封，送实验室。54样品制备541水泡液、口腔分泌物、血液和精液样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 rain，取上清液转GBT 229 1 62008人无菌的15mLEppendorf管中，编号备用。542水泡皮、肌肉或组织脏器取待检样品20 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4下以3 000 rmin离心15 rain，取上清液转入无菌的15 mL Eppendorf管中，编号备用。55样本存放制备的样本在28条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应置于一70以下，但应避免反复冻融(冻融不超过三次)
9、。6操作方法61实验室要求水泡性口炎病毒荧光RTPCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区；各工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；每一区域应有专用的仪器设备；进入各个工作区域应严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区。62样本的处理621在样本制备区进行。样品中总RNA提取的试剂盒，有商品化试剂盒出售，也可自行配制。622取n个灭菌的15mL Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)，编号。623每管加入600 pL裂解液，分别加入被检样
10、本、阴性对照、阳性对照各200 pL，一份样本换用一个吸头，再加入200 pL三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4以12 000 rmin离心15 min。624取与622相同数量灭菌的15 mL Eppendorf管，加入500 pL异丙醇(一20预冷)，做标记。吸取623各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500 pL，不能吸出中间层，颠倒混匀。625于4、以12 000 rmin离心15 min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)
11、；加入600 pI。75乙醇，颠倒洗涤。626于4、以12 000 rmin离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。627以4 000 rmin离心10 s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min，不能过于干燥，以免RNA不溶。628各管加入11 pLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，以2 000 rmin离心5 S，冰上保存备用。提取
12、的RNA应在2 h内进行PCR扩增；若需长期保存应放置于一70冰箱内。63检测631扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，以2 000 rmin离心5 S。设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n-“+2+1)，其中“为被检样品数、2为阳性对照数、1为阴性对照数，每个样品测试反应体系配制见表1。GBT 229162008表1 反应体系混合液的配制序号 组 分 每管用量pL ”管总用量pLl 荧光RT PCR反应液(2) 25 n252 Taq酶 l nXl3 RT PCR反转录酶颗粒 12(颗) nX 12(颗)4 RNA酶抑制
13、剂(RNasin) 1 n1ROX参考染料5 1 n1(ROX reference dye)6 DEPC水 12zL n12632反应体系混合液分装根据测试样品的总数(n)，计算好各试剂的使用量，加入到适当体积的试管中，向其中加入n12(颗)RT_PcR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装40pL，转移至样本处理区。633加样在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加入628中制备的RNA溶液10 pI。，盖紧管盖，以500 rmin离心30 s。将PCR管放于96孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管、阴性对照管，转移至检测区。634荧光RT-PCR检测6341 在
14、检测区进行。将632中离心后的PCR管放人荧光RTPCR检测仪内，记录样本摆放顺序。在96孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(PC)、阴性对照(NTC)。设置探针：5为FAM，3为TAMAR。6342循环条件设置：第一阶段，反转录4230 min；一第二阶段，预变性923 min；第三阶段，9210 S，4530 s，721 mln，5个循环；第四阶段，9210 S，6030 s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和c值判定结果。7结果判定71 结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行
15、调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。72质控标准721阴性对照无c值，并且无扩增曲线，一直为水平线。722阳性对照的c值应小于280，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，否则，此次实验视为无效。73结果描述及判定731 阴性无c值并且无扩增曲线，表示样品中无水泡性口炎病毒。732阳性Cf值小于等于300，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在水泡性口炎病毒。733有效原则c值在30o355的样本建议重做。重做结果无c值或大于350者为阴性，否则为阳性。4A1 A液附录A(规范性附录)试剂的配制GBT 229 1 62008o2 molL磷酸二氢钠水溶液：磷酸二
16、氢钠(NaHzPO；H z0)276 g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1 000 mL。A2 B液o2 molL磷酸氢二钠水溶液：磷酸氢二钠(Na：HPO。7HzO)536 g(或NazHPOt12HzO716 g，或NazHPOt2HzO 356 g)，加蒸馏水溶解，最后稀释至1 000mL。A3 001 molL、pH72磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制取A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠(NaCD 85 g，用蒸馏水稀释至1 000 mL。经12115 rain高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加入l 000 IU青霉素、1 000 pg链霉素。SGBT 229162008附录B(资料
17、性附录)试剂盒的组成B1试剂盒组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：裂解液DEPC水RTPCR反应液(内含水泡性口炎病毒的引物、探针)RTPCR酶Taq酶阴性对照阳性对照(非感染性体外转录RNA)ROX参考染料(ROX reerence dye)30mL1盒2mL1管750“L1管2颗粒12管12*L1管1mL1管2mLXl管01mLXl管B2说明B21裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4保存。B22 DEPC水是用1DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。B23 RTPCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。B3功能试剂盒可用于动物组织样品(包括水泡皮、水泡液、组织、脏器、分泌物、血液等)中水泡性口炎病毒的检测。B4使用时的注意事项B41 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。B42反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。B43 RT PCR酶颗粒极易吸潮失活，应在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。
