1、ICS 67050X 04 国亘中华人民共和国国家标准GBT 22959-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of chloramphenicol，thiamphenicol andflorfenicol residues in fugu，eel and baked eelLCMSMS method20081231发布 2009050 1实施宰瞀鹳紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 置GBT 22959-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单
2、位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林海丹、李宪华、谢守新、林峰、黄华军、邵琳智、庞国芳。河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22959-20081范围本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素(chloramphenic01)、甲砜霉素(thiamphenic01)和氟苯尼考(florfenic01)及其代谢物氟苯尼考胺(florfenicol amine)残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的测定。本标准的方
3、法检出限：河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素为01 pgkg，甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺为10 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 63791-2004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测
4、量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792-一2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理样品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正己烷液液分配脱脂。液相色谱一串联质谱仪检测，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考以内标法峰面积定量，氟苯尼考胺以外标法峰面积定量。4试剂所用试剂除注明外均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙酸乙酯。43正己烷。44氨水：25-28。45无水硫酸钠
5、：使用前经650灼烧4 h。46标准物质：氯霉素(CAS：56757)、甲砜霉素(CAS：15318453)和氟苯尼考(cAs：76639946)，纯度995；氟苯尼考胺，纯度980。47内标标准液：氘代氯霉素(d；一氯霉素)，100 pgmL，溶剂为乙腈，氘化度98。48 100 PgmL标准储备液：分别准确称取适量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质(46)，用甲醇分别配成100 t-gmL的标准储备液。该溶液于一18保存。49 1gmL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准储备液：分别准确吸取100 mL氯霉素、甲砜霉1GBT 22959-2008素和氟苯尼考标准储备液(48)，
6、移至100mL容量瓶中，用甲醇配成1 pgmL的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准储备液。该溶液于一18保存。410 1 pgmL氟苯尼考胺标准储备液：准确吸取100mL氟苯尼考胺标准储备液(48)，移至i00mL容量瓶中，用甲醇配成1#gmL的氟苯尼考胺标准储备液。该溶液于-18保存。411 20 ngmL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准中间液：准确吸取100 mL混合标准储备液(49)，移至50mL容量瓶中，用水配成20 ngmL的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合标准中间液。该溶液于4保存。412 20 ngmL氟苯尼考胺标准中间液：准确吸取100 mL氟苯尼考胺标准储备液(410)，移至
7、501L容量瓶中，用水配成20 ngmL的氟苯尼考胺标准中间液。该溶液于4保存。413 1 tLgmL内标标准储备液：准确吸取100 pL内标标准液(47)，移至10 mL容量瓶中，用甲醇配成1 btgmL内标标准储备液。该溶液于一18保存。414 20 ngmL内标标准中间液：准确吸取1-00 mL内标标准储备液(413)，移至50 mL容量瓶中，用水配成20 ngmL的内标标准中间液。该溶液于4保存。415氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考混合基质标准工作溶液：根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，临用时吸取一定量的混合标准中问液(411)和内标标准中间液(414)，用空白基质溶液配成适当浓度的混合
8、基质标准工作液，每毫升该混合基质标准工作溶液含有015 ng氘代氯霉素(d；氯霉素)。416氟苯尼考胺基质标准工作溶液：根据标准的灵敏度和仪器线性范围，f临用时吸取一定量的标准中间液(412)，用空白基质溶液配成适当浓度的氟苯尼考胺基质标准工作液。417滤膜：02 ptm。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53离心机：转速4 000 rmin。54小型台式离心机：转速13 000 rrain。55组织捣碎机。56匀浆机。57减压旋转蒸发仪。58超声波水浴。59旋涡振荡器。510聚丙烯离心管：带盖，50 mL，15 mL。511鸡心瓶：2
9、5mL。512具塞比色管：50 mL。6试样制备与保存61试样的制备从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500 g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器，密封，并标明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样的保存将试样于一18冰箱中保存。27测定步骤GBT 22959-200871提取称取5 g试样，精确至001 g，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入内标标准中间液(414)750 pL，加入25 mL乙酸乙酯，075 mL氨水(44)，3 g无水硫酸钠，匀浆提取30 s，4 000 rrain离心5 min，上清液转移至50 mL比色管中。另取一50 m
10、L离心管加入20 mL乙酸乙酯，060 mL氨水，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，旋涡振荡提取1 min，超声波振荡提取5 rain，4 000 rmin离心5rain，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至500mL。摇匀后移取100mL乙酸乙酯提取液于25 mL鸡心瓶，45减压旋转浓缩至干。72净化鸡心瓶中的残渣用200 mL水溶解，旋涡振荡混匀，超声5 min，加入3 mL正己烷旋涡振荡混合30 S，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3 mL正己烷旋涡振荡混合30 S，静置分层，移取部分下层的水相于15 mL的聚丙烯离心管中，13 000 rmin离心5
11、 rain，经02 pm滤膜过滤后，供液相色谱一串联质谱测定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。另吸取100 pL滤液于液相进样瓶，加入400 pL水，混匀，供液相色谱一串联质谱测定氟苯尼考胺。73空白基质溶液的制备称取5 g空白样品，精确至001 g，除不加入内标标准中间液，其他按71和72步骤操作。74测定条件741液相色谱参考条件7411 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考测定a)色谱柱：SUPELCO Discovery ClB，5 pm，150 mmX 2I ram(内径)或相当者；b)柱温：40；c)流动相：甲醇一水(2+3)；d)流速：030 mLmin；e)进样量：20 pL。7412氟苯尼考
12、胺测定a)色谱柱：Intersil C83，5 pm，150 ram：X：46 ram(内径)或相当者；b)柱温：40；c)流动相：甲醇一水(4+1)；d)流速：030 mLmin；e)进样量：10 pLa742质谱参考条件a) 离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：负离子扫描(氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考测定)，正离子扫描(氟苯尼考胺测定)；c) 检测方式：多反应选择离子检测(MRM)；d)电喷雾电压(1s)：一4 200 V(氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考测定)，4 500 V(氟苯尼考胺测定)；e)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使
13、质谱灵敏度达到检测要求；f)辅助气温度(TEM)：600；g)定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表1。GBT 22959-2008表1氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氘代氯霉素(ds-氯霉素)和氟苯尼考胺的质谱参数定性离子对 定量离子对 采集时间 去簇电压 碰撞能量化合物名称(mz) (mlz) V32092570 16氯霉索 3209152o 200 5532091520 2635392903 17甲砜霉素 35391852 200 553539852 2735603360 14氟苯尼考 35603360 200 55356O1850 27氘代氯霉素(也一氯霉索) 326，o
14、57o 326o57o 200 55 2624832302 18氟苯尼考胺 2483302 200 452483130 2 33743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待检测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允
15、许的最大偏差 士20 士25 士30 土507432定量测定氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考测定以内标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作溶液(415)进样，以标准溶液中被测组分峰面积和氘代氯霉素(d。氯霉素)峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度与氘代氯霉素(也氯霉素)浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。氟苯尼考胺测定以外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作溶液(416)进样，以标准溶液中被测组分蜂面积为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品
16、溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氘代氯霉素(ds-氯霉素)和氟苯尼考胺标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1图A3。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算氯霉素甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定结果按式(1)计算：4GBT 22959-2008x一会毒含署獬式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；“基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)
17、；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；“试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；“基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。，基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。氟苯尼考胺残留量的测定结果按式(2)计算：xc署揣u m 1 U U式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从基质标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)y样品溶液最终定容体积
18、，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度(2)91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表3。表3 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R河豚鱼 lgr-113 lgm+0691 IgR=107|gin+0677氯霉素 0100100 鳗鱼 IgrTM0979 lgm+
19、0762 lgR=100 lgm+0762烤鳗 Igr-111 lgm+0635 lgR；101 lgm+o 632河豚鱼 lgr=0753 lg0 033 1 lgR=108 19m一0062 2甲砜霉素 i00100 鳗鱼 lgr=099 lgm-u0 170 lgR=0996 lgm-u0 150烤鳗 lgr=0883 lgm一0096 9 IgR=104 Ig优一0111GBT 22959-2008表3(续) 单位为微克每千克化合物名称 添加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R河豚鱼 19r一0985 lgm一0146 IgR-0997 lgm一0127氟苯尼考 1 0010O
20、鳗鱼 lgr=0956 Igm一0159 gR=0981 lgm一0130烤鳗 Igr=0973 lgmO115 lgR101 19m一0 148河豚鱼 lgr=109 lgm一0179 lgRO974 lgm 0143氟苯尼考胺 1OO800 鳗鱼 lgr=112 lgm一0190 19R=O983 lgm一0170烤鳗 lgr-117 19m一0200 19RO969 lgm一0177注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现
21、性方程见表3。附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图GBT 22959-2008氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质的多反应监测色谱图见图A1，氘代氯霉素的多反应监测色谱图见图A2，氟苯尼考胺标准物质的多反应监测色谱图见图A3。童3-0e4谭20e42 3c42 0e4号1 5e4癌型l-0c4罾5 000 0。6Oe4趔4 Oe4捌蛋L0 5 1 0 15 2 0 25 30 3 5 4 0train353 9185 21 990 5 1 0 l 5 2 9 25 3 0 3 5 4 0dram356 0336 010 5 10 15 2 0 25 3 0 3 5 4 0tm
22、inP 2Oe4趔埘香1 Oe4趔10c4罾50。44 Oe4莹3oc4j鹫霎置410e4。O320 92970 370L0 5 1 0 1 5 2 0 9 5 3 0 35 4 0tmm3539290 3l 890 5 10 1 5 20 2 5 3 0 35 40t|rain356 O185 0几 10 5 10 l 5 2 0 25 3 0 3 5 40train图A1 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准物质的多反应监测(MRM)色谱图GBT 22959-2008100e48 000002 OOO 0032091570 3 63L0 5 1 0 1 5 2 0 25 30 3 5 4 0tm
23、in图A2氘代氯霉素(d5一氯霉素)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图2Oe4孚藿1+0e4辱00248 323024 000量藿2 000誉O248 3130 22 4 6 8 2 4 6 8t|min train图A3氟苯尼考胺标准物质的多反应监测(MRM)色谱国0064导掣键譬GBT 22959-2008附录B(资料性附录)回收率氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加浓度及平均回收率的试验数据见表B1。表B1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的添加浓度及平均回收率的试验数据样品基质 化合物名称 添加浓度(#gkg) 平均回收率o100 92oo200 962氯霉素o500
24、99o1oo 92o1oo 1022 00 926甲砜霉素4oo 96410o 943鳗鱼1oo 95o2oo 952氟苯尼考4oo 98 Oloo 98o1oo 9772oo 957氟苯尼考胺4oo 9548oo 102o100 932o200 967氯霉索O500 956100 951100 916200 913甲砜霉素400 889100 882河豚鱼1_00 926200 102氟苯尼考400 925100 894100 961200 913氟苯尼考胺400 944800 935GBT 22959-2008表B1(续)样品基质 化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率o100 967o200 979氯霉素o500 9761OO 959100 857200 912甲砜霉素400 92 1100 878烤鳗100 970200 971氟苯尼考400 95910 0 918100 937200 934氟苯尼考胺400 957800 96310
