1、ICS 67050X 04 园亘中华人民共和国国家标准GBT 22962-2008河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of altrenogest，chiormadinone residuesin fugueel and baked eelLCMSMS method200812-31发布 2009-05-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局岩右中国国家标准化管理委员会仅111日U 吾GBT 22962-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和
2、国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：康海宁、谢丽琪、肖来龙、赵琼晖、张建莹、庞国芳。河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2296220081范围本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素(altrenogest)和氯地孕酮(chlormadinone)残留量的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的确证和定量测定。本标准方法检出限：烯丙孕素和氯地孕酮的检出限均为05 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，
3、其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 5725-1：1994，IDT)6BT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB7T 63792 20。4，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682一-2008，ISO 3
4、696：1987，MOD)3原理试样在37经过16 h酶解后，采用乙腈提取试样中残留的烯丙孕素和氯地孕酮，提取液经乙腈饱和正己烷脱脂、固相萃取柱净化。电喷雾离子化，液相色谱一串联质谱检测和确证，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43正已烷：色谱纯。44甲酸：色谱纯。45乙酸铵：色谱纯。46氯化钠。47乙酸钠。48乙酸。49卢一葡萄糖苷酸硫酸酯酶：116 300 unitmL。410乙酸钠缓冲溶液：02 molL，pH 52。称取164 g乙酸钠(47)溶解于800 mL水中，用乙酸(48)调节pH值至
5、52，用水定容至1 000 mL。411 乙腈饱和正己烷：取500 mL正己烷(43)，加入适量乙腈(42)，充分振摇后，待两相分层，上层即为乙腈饱和正己烷溶液。1GBT 22962-2008412 20乙腈水溶液：量取20mL乙腈(42)和80mL水，混合均匀。413样品定容溶液：量取50 mL乙腈(42)和50 mL水，混合均匀，加入01 mL甲酸(44)，混合均匀。414 0005 molL乙酸铵(含005甲酸)：准确称取03854 g乙酸铵(45)，用水溶解并转移至1 000 mL容量瓶中，加入05 mL甲酸(44)，用水定容至刻度线。415标准物质：烯丙孕素(CAS：850502)、
6、氯地孕酮(CAS：302227)，纯度均大于99。416标准储备溶液：分别称取适量的烯丙孕素和氯地孕酮标准物质(415)，用甲醇(41)配制成浓度为100 mgL的标准储备溶液，一18以下避光保存。417混合中间标准溶液I：吸取适量的各标准储备溶液(416)，用甲醇(41)稀释成浓度为10 mgL的混合中间标准溶液I，04避光保存。418混合中间标准溶液：吸取适量的各标准储备溶液(416)，用甲醇(41)稀释，配制成烯丙孕素浓度为15 mgL，氯地孕酮浓度为10 mgL的混合中间标准溶液，04避光保存。419 HLB固相萃取柱或相当者：60 mg，3 mL。使用前用5 mL甲醇，5 mL水活化
7、，保持柱体湿润。420滤膜：02 tLm。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52均质器。53旋涡混匀器。54恒温空气浴摇床。55固相萃取装置。56吹氮浓缩仪。57分析天平：感量01 mg和001 g。58移液器：10 pL100 pL和100弘L1 000 pL。59聚丙烯离心管：15 mL和50 mL，具塞。510容量瓶：100 mL和1 000 mL。51 1离心机：转速不低于5 000 rrain。6试样制备与保存61试样制备河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中，加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所有可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，
8、装入清洁容器内，并标明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。62试样保存试样于18以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在26贮存72 h。7测定步骤71样品提取称取待测样品50 g(精确至001 g)于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙酸钠缓冲溶液(410)，30 pL葡萄糖苷酸硫酸酯酶(49)，旋涡振荡2 min，置于37恒温空气浴摇床中酶解16 h。酶解后的样品溶液冷却至室温后，加入10 mL乙腈(42)，旋涡混匀1 rain，在往复式振荡器上振荡提取5 min，3 000 rmin离心5 rain，将上清液转移至另一50 mL离心管中。在残渣中加入10 mL乙腈
9、，重复提取2GBT 22962-2008一次，5 000 rmin离心5 rain，合并乙腈层。在乙腈提取液中加入5 g氯化钠(46)，旋涡混匀1 rain，5 000 rmin离心3 rain。取上层乙腈层8 mL于15 mL离心管中，加入4 mL乙腈饱和正己烷溶液(411)，充分振摇，5 000 rrain离心3min，弃去上层有机溶液。再加入4mL乙腈饱和正己烷溶液，重复上述操作一次。将经脱脂处理后的乙腈提取液置于45水浴下吹氮浓缩至2 mL，加水定容至10 mL，待净化。72净化将71中所得溶液转入活化好的HLB固相萃取柱(419)中，以约3 mLmin的流速使样液全部通过固相萃取柱，
10、弃去流出液。再分别用3 mL 20乙腈水溶液(412)、3 mL水淋洗，弃去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱15 rain。用3 mL乙腈洗脱被测物于15 mL离心管中，45水浴下吹氮浓缩至近干，用样品定容溶液(413)溶解并定容至10 mL，旋涡混匀后过02,um滤膜(420)，用液相色谱一串联质谱仪测定。73基质空白液和基质混合标准工作液的制备称取阴性样品50 g(精确至001 g)于50 mL具塞离心管中，按71和72操作制备基质空白液；混合标准工作液根据需要于使用前用基质空白液配制。74测定条件741液相色谱参考条件a) 色谱柱：c。8色谱柱，17 pm，50 mmX 21 ram(内径
11、)或相当者；b)柱温：40；c)进样量：10 gL；d) 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间rain 流速(mLmin) 0005 molL乙酸铵溶液(含005甲酸) 甲醇00 030 50 5050 030 20 8060 030 5 956 1 030 50 507 5 0 30 50 50742质谱参考条件a)离子化模式：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d)分辨率：单位分辨率；e)电喷雾电压：3 000 V；f)辅助气流速：700 Lh；g)碰撞气：氩气；h)幕帘气流速：50 Lh；i)离子源温度：105；j
12、)辅助气温度：400；k)定性离子对、定量离子对、采集时间、锥孔电压及碰撞能量见表2。GBT 229622008表2烯丙孕素和氯地孕酮测定的质谱参数化合物名称 参考保留时间rain 母离子 子离子 采集时间s 锥孔电压V 碰撞能量eV2271 24烯丙孕素 333 311 1 01 402692 18309z| 16氯地孕酮 364 4050 o1 Z63013 208为定量离子，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与基质标准溶液的
13、保留时间偏差在土25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10l 允许的最大偏差 士20 士Z5 土30 士507432定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合基质标准溶液进样以峰面积为纵坐标，混合基质标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图参
14、见附录A中的图A1。烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。7433平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7434回收率试验吸取适量混合标准中间溶液，用空白基质溶液稀释成所需浓度的标准工作溶液。阴性样品中添加标准溶液，按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算试样中烯丙孕素和氯地孕酮的残留量按式(1)计算：X一警獬“1) 优 1 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每升(,ugL)；V样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m最终样品溶液所代表的试样质量，
15、单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值4GBT 22962-2008以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 烯丙孕素和氯地孕酮的含量范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克化合物名称 舔加浓度范围 样品基质 重复性限r 再现性限R河豚鱼 lgr=0 994 6lg，l 106 5 lgR=O888 319m一0688 4烯丙孕素 o56o 鳗鱼 lgr=0720 2lgm 1
16、030 3 gR=o843 419m一0760 2烤鳗 lgr=0804 319m一1195 8 lgR一0668 419优一O703 4河豚鱼 tg r-0749 6lgm一0856 6 lgR一0663 4lgmO636 1氯地孕酮 0 540 鳗鱼 lgr=0836 119m一0858 4 lgRO815 7lgm一0595 4烤鳗 lgr-1261 219m 1084 5 lgR一0950 5lgm一0658 0注；m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限
17、R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 22962-2008附录A(资料性附录)标准溶液多反应监测(MRM)色谱图烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。1 oo 2 oo 3oo 4 oo图A1 烯丙孕素和氯地孕酮标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图1361脂一3i、TC索i一4孕lHniiHH丙E_仳烯娼一乱一丛 OGBT 22962-2008附录B(资料性附录)回收率河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据见表B1。表B1 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据添加浓度 回收率范围化合物名称(卜gkg) 河豚鱼 鳗鱼 烤鳗05 725105 636-785 82511015 73，9866 735-850 79 6891烯丙孕素3o 694818 79393o 75 68396 0 724789 81 2863 72482 405 732108 835107 99411810 81 0101 806805 81 2105氯地孕酮Z 0 8I9-9S7 867958 8118704 0 908107 857950 83 5874
