1、ICS 67050X 04中华人民共和国国家标准GBT 22965-2008牛奶和奶粉中1 2种p一兴奋剂残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of 1 2 pagonists residues in milk and milk powderLCMsMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施宰瞀徽鬻瓣訾麟瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19刖 昌GBT 229652008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标
2、准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、余孔捷、黄杰、李耀平、陈健、庞国芳。牛奶和奶粉中12种p一兴奋剂残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22965-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中12种p兴奋剂残留量的液相色谱一串联质谱的测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中12种兴奋剂多残留的测定。12种p一兴奋剂药物包括溴布特罗(brombuter01)、塞曼特罗(cimater01)、克仑特罗(clenbuter01)、克仑潘特(clenpenter01)、羟甲基氨克仑特罗(hydroxymethylclenbuter01)、苯氧丙酚胺(isoxsuprine)、马布特罗(mabuter01)、莱
3、克多巴胺(ractopamin)、利托君(ritodrine)、沙丁胺醇(salbutam01)、特布他林(terbutaline)和妥布特罗(tulobuter01)。本标准的的方法检出限：牛奶中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为005 pgkg，溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出限为025 pgkg；奶粉中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的检出限为o4 pgkg，溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的检出限为20 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过
4、本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试
5、验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理样品经稀酸水解、高氯酸沉淀蛋白后，残留的p一兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取，混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱净化，液相色谱一串联质谱测定，内标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42异丙醇。43乙酸乙酯。44乙腈：色谱纯。45甲酸。46高氯酸。1GBT 22965-200847盐酸。48氢氧化钠。49乙酸铵：色谱纯。410氨水。411氯化钠。412 10 molL氢氧化钠溶液：称取40 g氢氧化钠至100 mL水中，混匀。413 01 mo
6、lL高氯酸溶液：移取04 mL高氯酸至100 mL水中，混匀。414 0i molL盐酸溶液：移取085 mL盐酸至100 mL水中，混匀。415 5 mmolL乙酸铵溶液：称取0385 g乙酸铵至约800mL水中，加入2 mL甲酸，定容至1000 mL，混匀。416 甲醇一01甲酸溶液：移取01 mL甲酸于约50 mL水中，加入i0 mL甲醇，以水定容100 mL，混匀。417标准物质：溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，纯度大于98o。418内标标准物质：盐酸克仑特罗一D9、盐酸莱克多巴胺一D5、
7、沙丁胺醇一D3，纯度大于98o。419标准储备液(100-gmL)：准确称取适量的溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，用甲醇分别配制成100 pgmL的标准储备液，一20冰箱中保存。420混合标准储备液(1 pgmL)：分别准确量取10 mL的标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20冰箱中保存。421内标储备液(100,ugmL)：准确称取适量的克仑特罗一D9、莱克多巴胺一D5、沙丁胺醇一D3对照品，用甲醇配制成100 p-gmI。的标准储备液，一20冰箱中保存。422内标工作液(1
8、0 ngmL)：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释定容成浓度为10 ngmL的同位素内标工作液，一20下冰箱中保存。423基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用现配。424混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60 mg3 mL，使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，保持柱体湿润。425滤膜：02,um。5仪器和设备51 高效液相色谱一串联质谱仪：配电喷雾电离(ESI)源。52天平：感量01 mg和001 g。53组织捣碎机。54高速冷冻离心机：转速可达15 000 rmin，制冷可达4 oC。55离心机：5 000 rra
9、in。56旋涡振荡器。57电热恒温振荡水槽。58 pH计。59旋转蒸发仪。510固相萃取装置。511氮吹仪。26试样制备和保存GBT 22965-200861试样制备取不少于500 g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份，置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样保存牛奶置于4冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存。7测定步骤71提取7I1牛奶准确称取10 g(精确到001 g)牛奶样品于50 mL聚丙烯离心管内，加入50 pL 10 ngmL的内标物，加入20 mL 01 molL盐酸溶液(414)，涡旋混匀，于37下避光水浴振荡16 h(过夜)，取出冷却至室温，涡旋混匀，4下15
10、000 rmin离心10 rain，分取10 mL上清液转移至另一50raL离心管内。加入5mL 01molL高氯酸溶液(413)，用iomolL氢氧化钠溶液(412)调节pH值至9703，加入约2 g氯化钠，再加入25 mL异丙醇一乙酸乙酯(3+2)，涡动提取2 min，4 500 rmin离心5 rain，取出上清液至另一50 mL离心管中。再在下层水相中加15 mL乙酸乙酯一异丙醇(7+3)，涡动提取1 rain，4 500 rmin离心5 rain，合并有机相，40下旋转蒸发至近干，加入5 mL 01 molL盐酸溶液(414)，涡动1 rain，待净化。7I2奶粉取125 g奶粉于烧
11、杯中，加适量3550水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总质量为100 g，充分混匀后准确称取10 g(精确到001 g)样品于50 mL聚丙烯离心管中，按711步骤进行处理。72净化将71所得溶液以约1 mLmin的流速全部过混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱(424)，依次用3 mL水、3 mL 2甲酸水溶液和2 mL甲醇淋洗，抽千，用5 mL 5氨水甲醇溶液(体积分数)洗脱，洗脱液于40下以氮气吹至近干，以05 mL甲醇一01甲酸溶液(1+9)溶解，涡动混匀，过02 pm滤膜(425)，供液相色谱一串联质谱仪测定。73空白基质溶液的制备称取阴性样品10 g(精确至001 g)，按71和72
12、步骤操作。74测定条件741液相色谱参考条件a)色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，17 pm，21 mm55 mm(内径)或相当者；b)流动相：A为5mmoIL乙酸铵溶液(415)，B为01甲酸乙腈(体积分数)，梯度洗脱，洗脱程序见表1；表1梯度洗脱程序时间w-in A B000 85 1510 85 1520 30 7025 30 7030 85 1550 85 15GBT 22965-2008c)流速：025 mLmin；d)柱温：30；e) 进样量：10 pL。742质谱参考条件a)离子源：电喷雾源(ESI)，正离子模式；b)扫描方式：多反应监测(MRM)；c)毛细管电压
13、：15 kV；d)源温度：120；e)去溶剂温度：450f)锥孔气流(氮气)：45 Lh；g)去溶剂气流(氮气)：700 Lh；h)碰撞气压(氩气)：22010Pa；i)驻留时间：020 s。743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合基质标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
14、 以表示相对离子丰度K K50 20KSO 10K20 K10允许的相对偏差 20 士25 士30 土507432定量测定内标法定量：用混合标准工作溶液分别进样，以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标，以分析化合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，标准工作液和待测液中12种药物的响应值均应在仪器线性响应范围内。12种p兴奋剂类药物的保留时间、母离子和子离子见表3。12种p一兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1，添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。表3 12种兴奋剂保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰
15、撞能量保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量化合物名称(卅z) (mz) V eV302164 15莱克多巴胺 2oo 302164 25 302284 12240148 18沙丁胺醇 075 240148 20 240166 13220160 15塞曼特罗 0 84 220160 18220202 10291203 15克仑潘特 225 291203 20291273 104表3(续)GBT 22965-2008保留时间 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量化合物名称Onz) (rez) V eV277203 15克仑特罗 215 277203 26277259 1136
16、7293 18溴布特罗 220 367293 18367349 13228119 25妥布特罗 213 228154 21228154 1631l237 16马布特罗 225 31l237 20311293 11226125 22特布他林 078 226152 20226152 16288121 20利托君 125 288270 2028827C 12302150 22苯氧丙酚胺 222 302150 20302284 14293203 15羟甲基氨克仑特罗 1 95 293203 18293275 12克仑特罗一D9 213 286204 286204 26 15沙丁胺醇一133 075 2
17、43151 243i5i 20 18莱克多巴胺一D5 200 308168 308168 25 15采用克仑特罗一D9定量的化合物有：克仑潘特、克仑特罗、溴布特罗、妥布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺。采用沙丁胺醇一D5定量的化合物有：沙丁胺醇、塞曼特罗、特布他林。采用莱克多巴胺一D5定量的化合物有：莱克多巴胺、利托君、羟甲基氨克仑特罗。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。8结果计算试样中p兴奋剂类药物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹揣UU“1) m l U式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ugkg)；c从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克
18、每毫升(ngmL)；y试样溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m。试样溶液最终所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。GBT 22965-20089精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 12种口一兴奋剂类药物的添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化合物名称 样品基质 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R牛奶 O0505 lgr=0942 3 19m
19、一0768 1 lgR=0980 8 lgm 0509 1莱克多巴胺奶粉 0440 lgr=1025 0 lgmi0706 lgR=1019 4 190 562 2牛奶 00505 lgr=0963 4 lgm 0415 0 lgR=0981 2 190 488 7沙丁胺醇奶粉 O440 lgr=1029 i lgm一0708 5 lgR=0975 4 lgm 0554 9牛奶 00505 19r=1097 1 lgm一0676 2 lgR=0 9191Igm 04941塞曼特罗奶粉 0440 lgr=1107 7 19m一0691 3 gR一0922 5 lgm一0489 8牛奶 00505
20、 19r一0946 7lg卅0 608 4 lgR=1006 6 lgm一0470 5克仑潘特奶粉 0440 lgr=1102llgm 0 675l IgR=1009 6 lgm 0470 2牛奶 00505 lgr=0988 4lgm 0 778 7 tgR=I056 4 lg0 513 6克仑特罗奶粉 0440 lgr=1081 6 190 654 4 lgR=1075 7 lgm一0556 9牛奶 02525 19r=0893 0 19m一0713 4 lgR=I033 0 lgm 0453 1溴布特罗奶粉 2，0200 19r=0931 0 19m 0618 0 lgR=I084 2
21、lgm一0512 0牛奶 02525 lgr=O905 4 19m一0493 6 lgR=0975 1 lgm一0561 1妥布特罗奶粉 20200 lgr=1184 319m 0 629 8 lgR=0957 5 lgm一0491 3牛奶 0 2525 lgr=0982 5 lg0 637 2 lgR=0933 5 lgm一0468 4马布特罗奶粉 20200 lgr一0912 4 lg0 629 7 lgR=O972 2 19m一0450 4牛奶 02525 Igr=0936 6 Igm一0732 8 lgR=0971 5 19m一0499 1特布他林奶粉 20200 lgr=0993 4
22、 lgmO735 5 lgR=0957 0 19m一0535 8牛奶 02525 lgr=0958 5 lgmO731 6 lgR=0932 6 lgm 0488 7利托君奶粉 20200 lgr=1099 9 lgmO774 2 lgR一1012 2 lgm 0605 9牛奶 02525 lgr=0963 2 lgmO755 8 lgR=0984 0 lgm一0520 8苯氧丙酚胺奶粉 2020 0 igr=0978 9 lgm一0676 8 IgR=0950 6 lgm一0554 0羟甲基氨克 牛奶 02525 lgr=0989 1 19m一0739 6 lgR一1001 2 lgm一04
23、68 4仑特罗 奶粉 20200 lgr=0918 6 lgmO497 0 lgR=0967 7 19m一0482 4如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的添加浓度范围及再现性方程见表4。附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱图12种p兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。l正，：二，二二1 00 200 300 4 00 5 00l 00 2 00 300 400 5 00train15203l姓，二二，一一二7 1 00 200 3 00
24、4 00 500lL一二二二，一一二1 100 200 306 400 5001 00 200 3 90 4 00 5 00100 2 00 360 4 00 5001 00 200 3 00 4 00 5 00GBT 22965-2008288 031121041oo 2 oo 3oo 4 oo 5oo1oo 2 oo 3oo 4 oo 5ool，一卫一=，一二1001 oo 2 oo 3oo 4 oo 5 601 oo 2oo 3 oo 4 oo 5 oo1 00 2 oo 3 oo 4 oo 500马布特罗 31096236 671 00 2 00 3 00 4 00 500溴布特罗 3
25、6677292 66图A1 12种兴奋剂类药物标准物质的多反应监测(MRM)色谱图m“m怖旧m0000GBT 22965-2008附录B(资料性附录)回收率12种p兴奋剂类药物的添加浓度及其平均回收率范围的试验数据见表B1。表B1 12种p一兴奋剂类药物的添加浓度及其平均回收率范围的试验数据平均回收率化合物名称 添加浓度(ffgkg)牛奶 奶粉o10 918 922o20 893 918莱克多巴胺o50 927 9141o 919 946o10 897 932o20 905 919沙丁胺醇050 903 9231 O 916 93Oo10 864 867o20 863 879塞曼特罗o50 8
26、68 8761o 87 5 863010 867 885o20 917 875克仑潘特o50 910 88 51o 899 881o10 93o 941020 947 919克仑特罗o50 932 91 81o 936 913o10 877 866020 889 849溴布特罗o50 885 8821o 871 862o50 881 8891o 899 851妥布特罗25 878 9045o 912 907o50 876 8221o 897 828马布特罗25 837 8625o 867 88oo50 855 87 21o 887 846特布他林25 87o 88550 864 867o50 86o 886利托君Io 876 8618表B1(续)GBT 22965-2008平均回收率化合物名称 添加浓度(pgkg)牛奶 奶粉25 825 855利托君50 890 838o50 879 87910 888 873苯氧丙酚胺25 881 87250 898 871050 851 8601_0 877 879羟甲基氨克仑特罗25 874 88950 866 8619
