1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 2297 12008牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定 液相色谱一串联质谱法200812-31发布Determination of metabolite residues of dipyronein milk and milk powder-LC_。MSMS method20090501实施宰瞀徽紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅棚1刖 舌GBT 2297 12008本标准附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民
2、共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：沈金灿、谢丽琪、肖陈贵、朱玉兰、熊贝贝、林燕奎、庞国芳。牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2297120081范围本标准规定了牛奶和奶粉中安乃近代谢物4一甲酰氨基安替比林(4一formylaminoantipyrine)、4-乙酰氨基安替比林(4一acetylaminoantipyrine)、4一甲基氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine)和4一氨基安替比林(4一aminoantipyrine)的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中4一甲酰氨基安替比林、4一乙酰氨基安替比林、4一甲
3、基氨基安替比林和4一氨基安替比林残留量的测定。本标准的方法检出限为：对于牛奶，4一甲酰氨基安替比林、4一氨基安替比林、4一甲基氨基安替比林和4一乙酰氨基安替比林均为50 pgkg；对于奶粉，4甲酰氨基安替比林、4一氨基安替比林、4一甲基氨基安替比林和4一乙酰氨基安替比林均为400 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准
4、确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 63791 2004，IS0 57251：1 994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT637922004，ISO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留加入Tris溶液后用乙腈提取，提取液经正己烷脱脂净化，液相色谱串联质谱仪测定。4一乙酰氨基安替比林、4一甲酰氨基安替比林和4一氨基安替比林采用外标法定量，4一甲基
5、氨基安替比林采用内标法进行定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42异丙醇。43乙腈：色谱纯。44三羟甲基氨基甲烷(Tris)。45乙酸铵：色谱纯。46 10 molL Tris溶液：准确称取121 g三羟甲基氨基甲烷，用水定容至100 mL。47样品定容溶液：甲醇一水(1+19)。1GBT 22971200848 5 mmolL乙酸铵溶液：准确称取0385 g乙酸铵，用950 mL水溶解，用乙酸将溶液调至pH 30，再加水定容至1 000mL。49 4一甲基氨基安替比林(4一methylaminoantipyrine，C1 z
6、Hl 5N30，CAS：519982)、4-乙酰氨基安替比林(4 acetyIaminoantipyrine，c13HlsN302，CAS：8315-8)、4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoantipyrine，ClzH】3N302，CAS：167Z一588)和4一氨基安替比林(4一aminoantipyrine，C11H13N10。CAS：83078)标准物质：纯度99。410内标标准物质：4异丙基氨基安替比林(4一isop”pylantipyrine，c，4H1 9N30)，纯度99。41 1 100 mgL标准储备溶液：准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质(49)，用甲醇
7、(41)配制成浓度为100 mgL的标准储备溶液，避光一18保存。412 10 mgL混合标准储备溶液：吸取每种适量标准储备溶液(411)，用甲醇稀释成10 mgL的混合标准工作溶液，避光一18保存。413 100 mgL内标储备溶液：准确称取适量的内标标准物质(410)用甲醇(41)配制成浓度为100 mgL标准储备溶液，避光一18保存。414 10mgL内标工作溶液：吸取适量的内标储备溶液(413)，用甲醇稀释成10mgmL的内标标准工作溶液，避光一18保存。415基质混合标准工作溶液：吸取适量的混合标准储备溶液(412)和适量内标工作溶液(414)，用空白样品提取液配成浓度为10 NgL
8、、50 ggL、100#gL、200 ttgL、400 pgL、t00 pgL和内标浓度为100zgL的基质混合标准工作溶液。当天配制。416滤膜：02 pm。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52旋转蒸发仪。53旋涡混匀器。54分析天平：感量01 mg和001 g。55移液器：10 pL100 pL和100“L1 000肛L。56带刻度聚丙烯离心管：15 mL和50 mL，具塞。57低温离心机：转速大于5 000 rmin，可制冷到4。58容量瓶：25 mL。59鸡心瓶。6试样的制备与保存61试样的制备取不少于500 g有代表性的牛奶或奶粉，充分混匀，分为两份
9、，置于样品瓶中，密封，并作上标记。62试样保存牛奶置于4冰柜中避光保存，奶粉则在室温下置于干燥器保存。7测定步骤71提取711牛奶称取5 g试样，精确至001 g，置于50 mL带刻度的聚丙烯离心管(56)中，加入100 pL内标工作2GBT 229712008溶液(414)和05 mL 10 molL的Tris溶液(46)，再加入10 mL乙腈，旋涡混合1 rain，振荡提取15 rain，4下5 000 rrain离心5 min，提取液转移至25 mL容量瓶(58)中。再加入8 mL乙腈，重复上述操作，合并提取液，用乙腈定容至25 mL，混匀。712奶粉取125 g奶粉，精确至001 g，
10、置于100 mL烧杯中，加适量3550水将其溶解，待冷却至室温后，加水至总重量为100 g，充分混匀后准确称取5 g(精确到001 g)样品于50 mL聚丙烯离心管中，按711步骤进行处理。72净化取50 mL提取液至干净的15 mL离心管中，加入30 mL乙腈饱和过的正己烷，旋涡振荡3 rain，4下5 000 rrain离心5 min，弃去正己烷层。将乙腈层转移至鸡心瓶(59)中，再加入50 mL异丙醇，在40下旋转蒸发至近干。残渣加入10 mL样品定容溶液(47)溶解，混匀后过滤膜(416)，供液相色谱一串联质谱测定。73空白基质溶液的制备称取阴性样品5 g(精确至001 g)，按71和
11、72步骤操作。74测定条件741液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：c。8色谱柱，17 pm，50 mm21 mm(内径)或相当者；b)柱温：40；c) 进样量：lo“L；d) 流动相、流速及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间mln 流速(mLmin) 5 mmoIL乙酸铵溶液(pH 30) 甲醇0 025 95 53O 025 85 154 0 025 10 9041 O25 95 555 0Z5 95 5742质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d)电喷雾电压：3 000
12、 V；e)碰撞气：氩气；f)辅助气流速：750 Lh；g)辅助气温度：350；h)离子源温度：105；i)参考保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量及锥孔电压见表2。GBT 229712008表2安乃近代谢物测定的质谱参数参考保留时间 定性离子对 定量离子对 碰撞能量 锥孔电压化合物名称(rez) (rez) eV Vz32104 21 284甲酰氨基安替比林276 23210423283 21 28204159 12 304氨基安替比林295 20415920483 13 3021856 15 244甲基氨基安替比林239 2185621897 13 24246228 13 324乙酰氨
13、基安替比林 279 246228246104 22 324一异丙氨基安替比林 24656 16 30328 24655(内标) 245125 13 30743液相色谱一串联质谱测定7431定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与基质混合标准工作溶液中对应的相对保留时间偏差在土25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 “相对离子丰度K K5
14、0 20KZ50 10K20 K，_10允许的最大偏差 土20 25 30 士507432定量测定在仪器最佳工作条件下，对基质混合标准工作溶液进样，以峰面积或峰面积比值为纵坐标，基质混合工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。四种安乃近代谢物标准物质和内标物的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。4一甲酰氨基安替比林、4一氨基安替比林和4一乙酰氨基安替比林采用外标法定量；4-甲基氨基安替比林以4一异丙基氢基安替比林作为内标，采用内标法进行定量。本方法对四种安乃近代谢物的添加回收率数据参见附录B中的表B1和
15、表B2。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算4一甲酰氨基安替比林、4一氨基安替比林和4一乙酰氨基安替比林结果按式(”计算：XX。v器 (1)m UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ttgkg)；f从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；4GBT 229712008m样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。4一甲基氨基安替比林结果按式(2)计算：x弘念毒等羔揣式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pg
16、kg)；c。基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；c试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；k基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；v样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本部分的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复
17、性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛奶和奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克化舍物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R4一甲酰氨基安替比林 5o50 培ro981 4 lg mo543 5 lg R一0903 1 lg0 501 6牛 4一氨基安替比林 5 050 lg r一10221lgm一0636 5 IgR=0964 9 lgm一0525 2奶 4甲基氨基安替比林 5050 lg T-O838 3tgm 0403 3 IgR=O844 9lgm 0409 84乙酰氨基安替比林 50
18、50 lg T-1033 3lgm O 655 4 lgR=0 973 1 lgm 0547 24一甲酰氨基安替比林 40 0400 lg r一0890 7 lgmO296 9 IgR一0993 1 lgm一0515 l奶 4一氨基安替比林 400400 lg r一1107 9lgm一0876 4 lgR=1087 9 lgm 0773 0粉 4甲基氨基安替比林 400400 lg T-O821 8lgm O198 2 lgR一0978 9 lg0 525 04一乙酰氨基安替比林 400400 Ig r一1 113 0Igm一08071 IgR一1079 3 Igm一0742 8注：拼为两次测
19、定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限T p应台弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，牛奶和奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 229712008附录A(资料性附录)标准物质的多反应监测(MRM)色谱圈四种安乃近代谢物标准物质及内标物的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。1002 95”20415c6。、，J L、“ h。o_m2 39 min21856一LJ200 4 004一氨基安替比林(AA)4甲基氨基安替比林(MAA)2 79rain23283一一 I2 00 40024622
20、8一止2 00 4 004一甲酰氨基安替比林(FAA)3 28 mI“24656 一2 00 400tmin4一乙酰氨基安替比林(AAA)4-异丙氨基安替比林(内标，Is)图A1 50 1w,L安乃近标准物质及内标物的多反应监测(MRM)色谱图附录B(资料性附录)回收率GBT 229712008本方法对于牛奶中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据，见表B1。表B1 牛奶中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据安乃近代谢物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率5o 97510o 9284甲酰氨基安替比林200 96o50o 9195o 96 710o 8864氨基安替比林20o
21、 83 7500 8555o 80410o 8474甲基氨基安替比林20o 84250o 85 550 90210o 95 14一乙酰氨基安替比林20o 97950 o 901本方法对于奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据，见表B2。表B2奶粉中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据安乃近代谢物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率40o 812800 9754一甲酰氨基安替比林1600 979400o 96640o 815800 9084氨基安替比林1600 988400o 927400 784800 8814一甲基氨基安替比林1600 9844000 96140o 79780o 9364一乙酰氨基安替比林1600 994400o 943
