1、ICS 67050X 04 囝园中华人民共和国国家标准GBT 22974-2008牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of isometamidium residues in milk and milk pOwderLCMSMS method200812-31发布 2009-050 1实施丰瞀髁紫瓣警辫瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪19刖 吾GBT 22974-2008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检
2、验检疫局、内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司。本标准主要起草人：潘国卿、张春艳、白国涛、刘来俊、郑书展、李红、张伟、常建军、李梅、庞国芳。牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22974-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中氮氨菲啶残留量的测定。本标准方法检出限：牛奶为0010 mgkg，奶粉为0080 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是
3、否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GBT 637912004，IS0 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3方法原理试样中的氮氨菲啶用乙腈和甲酸铵甲醇混合溶液提取，提取液经浓缩、脱脂后，用液相色
4、谱一串联质谱仪测定，外标法定量，选择离子定性。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42甲酸：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44正己烷：色谱纯。45甲酸铵。46 025 molL甲酸铵甲醇溶液：称取1576 g甲酸铵(45)溶于1 000 mL甲醇(41)中。47 80甲醇水溶液：量取80mL甲醇(41)加入20mL水中。48饱和了80甲醇水的正己烷溶液：在分液漏斗中加入300mL正己烷(44)，取适量80甲醇水溶液(47)进行振荡、静置分层，弃去下层甲醇水溶液，上层正己烷溶液备用。49提取液：量取乙腈(43)和025 molL甲酸铵甲醇
5、溶液(46)按照1：1(体积比)进行混合。410氮氨菲啶盐酸盐标准品：纯度大于或等于97。411氮氨菲啶标准储备溶液：准确称取适量氮氨菲啶盐酸盐标准品，用甲醇(41)配成浓度为100tgmL的标准储备溶液。此溶液在04冰箱中避光保存。412氮氨菲啶标准中间液：准确吸取5 mL的氮氨菲啶标准储备溶液(411)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(41)定容至刻度，配制成浓度为10 pgmL的氮氨菲啶标准中间液。该溶液于04冰箱1GBT 22974-2008中避光保存。413氮氨菲啶基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的氮氨菲啶标准中间液(412)，用阴性样品提取液稀释配制成浓度范围为25 ngmL20
6、0 ngmL的系列基质标准工作溶液，该溶液应现用现配。414滤膜：022m。5仪器和设备51液相色谱一串级质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52分析天平：感量001 mg和001 g。53振荡器。54超声波清洗器。55旋转蒸发器。56旋涡混合器。57离心机：转速不小于10 000 rmin。6试样的制备与保存61试样的制备611牛奶：取有代表性试样约500 g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识。612奶粉：取有代表性试样约500 g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识。准确称取12 g乳粉试样(精确到001 g)于250 mL烧杯中，少量多次加入50 mL煮沸并冷却到60左右的水溶
7、解，冷却至室温后，移入100 mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶，再用水定容到刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样。62试样的保存将试样于4以下保存。7测定步骤71提取与净化准确称取5 g牛奶试样(精确到0Ol g)或量取500 mL奶粉复原乳试样(612)于50 mL具塞离心管中，加入20 mL提取液(49)盖上盖混匀，置于振荡器上以300 rrain振荡10 min，在离心机中以10 000 rmin离心5 min，将上层溶液用滤纸过滤于鸡心瓶，残渣再用20 mL提取液(49)超声提取10 min，以i0000 rmin离心5 min，将上层溶液用滤纸过滤，合并二次滤液，
8、于低于40条件下旋转蒸发至近干(约剩余2 mL以下)，剩余液转移至10 mL具塞刻度离心管中，用甲醇(41)洗涤鸡心瓶，合并溶液并用甲醇(41)定容至500 mL，旋涡混匀1 min，然后加人5 mL饱和了80甲醇水的正己烷溶液(48)，旋涡混匀1 min，以3 000 rmin离心3 rain，弃去上层正己烷层，再加入5 mL饱和了80甲醇水的正己烷溶液(48)，旋涡混匀1 min，以3 000 rrain离心3 min，取下层溶液过02 pm滤膜(414)，供液相色谱一串联质谱测定。72阴性样品提取液的制备取不含氮氨菲啶的阴性牛奶或者奶粉样品，按71步骤制备阴性样品提取液，用于配制氮氨菲啶
9、基质标准工作溶液。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：Acquity UPLcTM BEH C18，17弘m，100 mmX 21 mm(内径)或相当者；b)柱温：35；2c)进样量：5“L；d)流动相及流速见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件GBT 22974-2008时间rain 流速(mLmin) 水(含02的甲酸) 甲醇000 03 10 Initial300 03 90 64 00 0 3 90 6450 03 10 6500 03 10 l732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多
10、反应监测(MRM)；d) 毛细管电压：1OO kV；e)锥孔电压：31 V；f)离子源温度：110；g)脱溶剂温度：400；h)脱溶剂气流量：450 Lh；i)锥孔气流量：50 Lh；j)碰撞室压力：0415 Pa；k)碰撞气氩气；1) 氮氨菲啶定量离子对、定性离子对及碰撞能量见表2。表2氮氨菲啶定性离子对、定量离子对、碰撞能量及驻留时间gNN子对(mz) 定性离子对(mz) 碰撞能量eV 驻留时间s46042985 23 o30460 4298546043】36 2l o 30733液相色谱一串联质谱测定7331定性测定在相同的实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的色谱峰保留时间与标
11、准品色谱蜂保留时间相差在25以内，且样品色谱图中定性离子的相对丰度与浓度相近的基质标准工作溶液色谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，相对偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在该种待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 士20 土25 士30 507332定量测定在仪器最佳工作条件下，对氮氨菲啶基质标准工作溶液(413)进行色谱分析，以峰面积为纵坐标，基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制，用标准工作曲线对样品进行定量，基质标准工作溶液和样液中氮氨菲啶的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱和质谱条件下，氮氨
12、菲啶的参考保留时间3GBT 22974-2008为270 rain。氮氨菲啶基质标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法的添加回收数据参见附录B中的表B1。7，4平行试验按上述步骤，对同一试样进行乎行试验测定，7，5空白试验除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。8结果计算样品中氮氨菲啶残留量的测定结果可由仪器工作站软件计算，也可按式(1)计算：x=c筹罴xF (1)7n l UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(ragkg)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(#gmL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试
13、样的质量，单位为克(g)；F换算系数，牛奶F一1，奶粉F=20，计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。9，2重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r)，试样中氮氨菲啶含量范围在0010 mgkgO10 mgkg之间时，重复性方程：牛奶为lg r-1135 5 Ig m0835 8，奶粉为lg r一1097 3 lg m一1002 7。如果两次测定值的差值超过重复性限(r)，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试
14、验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，试样中氯氨菲啶含量范围在o010 mgkg0，10 mgkg之闻时，重复性方程：牛奶为lg R一0，999 5 lg m一0815 9，奶粉为lg R一0895 0 lg m一0987 8。注：m为两次测定结果的算术平均值。附录A(资料性附录)标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图氮氨菲啶基质标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图，见图A1。GBT 22974-2008rL“25 o 5。o 75 1+oo 125 1鄹 1。75 2 00 2 25 2 5。2 75 3 00 1 25 3 50 3 750。2550 4 75靠忠图A1 氮氨菲啶基质标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图GBT 22974-2008附录B(资料性附录)回收率氮氨菲啶添加浓度及平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 氮氨菲啶添加浓度及平均回收率的试验数据样品基质 添加浓度(mgkg) 平均回收率001 892牛奶 002 900010 837001 856奶粉复原乳 002 898010 832
