1、ICS 67050X 04 圆目中华人民共和国国家标准GBT 22987-2008牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination for the residues of furaltadon，nitrofurazone，nitrofurantoin and furazolidone metabolites in milk and milk powderLCMSMS method2008-12-31发布 2009-05-0 1实施丰瞀鹛紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“”刖 昌本标准的附录A、附录B和附录c为资料性附录。
2、本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张进杰、曹亚平、刘晓茂、曹彦忠、王静淑、杨志伟、庞国芳。GBT 22987-2008牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 22987-20081范围本标准规定了牛奶和奶粉中呋喃它酮代谢物(5-吗啉甲基一3一氨基一2嚼唑烷基酮，英文缩写夯AMOZ)、呋喃西林代谢物(氨基脲，英文缩写为sEM)、呋喃妥因代谢物(1一氨基一2一内酰脲，英文缩写为AHD)和呋喃唑酮代谢物(3-氨基一2一晤唑烷基酮，英文缩写为AOz)残
3、留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于牛奶和奶粉中AM0z、SEM、AHD和AOZ残留量的测定。本标准的方法检出限：牛奶中AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为02#gkg；奶粉中AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为16 pgkg。注；本标准中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物中英名称及英文缩写参见附录A中的表A1。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最
4、新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO 5725 1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 5725-2：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理牛奶或奶粉试样用三氯乙酸水解并脱蛋白，硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2一硝基苯甲醛衍生化，用Oasis HLB或性能相当的固相萃取
5、柱净化。液相色谱一串联质谱仪(EsI+)检测。用内标法或外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为优级纯。41 水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸乙酯：色谱纯。45磷酸氢二钾，KzHPO；。46乙酸。47二甲亚砜。GBT 22987-200848盐酸。49 三氯乙酸，C2 Hcl302。410氢氧化钠。41 1 z硝基苯甲醛(2-NP)，C，H。NO。：含量99。412 01 molL磷酸氢二钾溶液：称取174 g磷酸氢二钾(45)，用水溶解，定容至1 000 mL。413 02 molL盐酸：量取17 mL浓盐酸(48)，用水定容至1 000 m
6、L。414 4moIL氢氧化钠溶液：称取80 g氢氧化钠(410)，用水溶解，定容至500mL。415 05 molL三氯乙酸溶液：称取375 g三氯乙酸(49)，用水溶解，定容至500 mL。416衍生剂：含2一硝基苯甲醛005 molL。称取0075 g 2-硝基苯甲醛(411)溶于10 mL二甲亚砜(47)，现用现配。417样品定容溶液：取10 mL乙腈(43)，03 mL乙酸(46)，用水稀释到100 mL。418标准物质：AM0z(CAS：43056-639)、SEM(CAS：563417)、AHD(CAS：2827567)和AOz(CAS：80一659)，纯度均99。419同位素标
7、记物标准物质：D。一AMOZ、”C“N SEM、“C3-AHD和D。一AOZ。四种内标标准物质的纯度均99。420 10 mgmL标准储备溶液：分别称取适量的四种硝基呋喃代谢物标准物质(418)，分别用甲醇稀释成10 mgmL的标准储备溶液。避光保存于一18冰柜中。421 01 ugmL混合标准溶液：分别吸取适量四种硝基呋喃代谢物的标准储备溶液(420)，用甲醇稀释成o1-gmL的混合标准溶液，避光保存于一18冰柜中。422 10 mgmL同位素标记物混合内标储备溶液：分别称取适量的四种硝基呋喃代谢物的同位素标记物标准物质(419)，分别用甲醇配成10 mgmL的标准储备液。避光保存于一18冰
8、柜中。423 01 ugmL同位素标记物混合内标溶液：分别移取适量的四种硝基呋喃代谢物的同位素标记物内标储备溶液(422)，用甲醇稀释成01,“gmL的混合内标标准溶液，避光保存于一18冰柜中。424 Oasis HLB固相萃取柱”或相当者：60 mg，3 mL。使用前依次用5 mL甲醇和10 mL水预处理，保持柱体湿润。425滤膜：02 ffm。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。52分析天平：感量01 mg和001 g。53液体混匀器。54固相萃取装置。55氮气吹干仪。56恒温振荡水浴。57真空泵：真空度应达到80 kPa。58微量注射器：25 pL，i00 ffL。5
9、9棕色具塞离心管：25 mL，50 mL。510 pH计：测量精度002pH单位。511贮液器：50mL。Z1) Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。512高速离心机：转速10 000 rrain以上。6试样的制备与保存61试样的制备实验室样品混合均匀，分出05 kg作为试样。62试样保存试样置于一18冰柜，避光保存。7测定步骤GBT 22987-200871待测样品溶液的制备711 牛奶样品脱蛋白、水解和衍生化称取牛奶样品8 g(精确到001 g)，置于
10、50 mL棕色离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液(415)。向上述离心管中加入02 mL衍生剂(416)，再加入适量混合内标溶液(423)，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为20 ngmL。用液体混匀器混匀，置于37恒温振荡水浴中避光反应16 h。离心管取出后放置至室温，在10 000 rrain下离心10 rain，上清液倒人另一棕色离心管中。712奶粉样品脱蛋白、水解和衍生化称取奶粉样品1 g(精确到001 g)，置于50 mL棕色离心管中，加入8 mL水，涡旋混合后，再加入15 mL三氯乙酸溶液(415)。向上述离心管中加入02 mL衍生剂(416)，再加入适量混合内标溶液(4
11、23)，使四种硝基呋哺代谢物内标物最终定容浓度均为20 ngmL。用液体混匀器混匀，置于37恒温振荡水浴中避光反应16 h。离心管取出后放置至室温，在10 000 rmin下离心10 rain，上清液倒人另一棕色离心管中。713样品溶液净化上述衍生溶液加入5 mL 01 molL磷酸氢二钾溶液(412)，用4 molL氢氧化钠溶液(414)调节溶液pH约为74，在10 000 rmin下离心10rain，上清液倒人下接Oasis HLB固相萃取柱(424)的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2 mLmin的流速通过Oasis HLB固相萃取柱(424)，待样液全部通过固相萃取柱后用20 m
12、L 20甲醇水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。抽于Oasis HLB固相萃取柱(424)15 rain。用5 mL乙酸乙酯(44)洗脱，收集洗脱液于25 mL棕色离心管中，在氮气吹干仪上45水浴吹干，准确加入10 mL样品定容溶液(417)溶解残渣，混匀后过02 p-m滤膜(425)，供液相色谱一串联质谱测定。72混合基质标准校准溶液的制备721 牛奶混合基质标准校准溶液的制备称取五个阴性牛奶样品，每个样品为8 g(精确到001 g)。分别加入适量混合标准溶液(421)，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为01 pgkg、02 pgkg、05 pgkg、10 pgkg和20 pgkg的基质标准溶液，
13、再分别加入适量混合内标溶液(423)，含量均为20 ngmL。同711和713操作，作为牛奶标准校准曲线。722奶粉混合基质标准校准溶液的制备称取五个阴性奶粉样品，每个样品为1 g(精确到001 g)。分别加入适量混合标准溶液(421)，制成四种硝基呋喃代谢物含量均为08#gkg、16 pgkg、4o pgkg、80 pgkg和16o pgkg的基质标准溶液，再分别加入适量混合内标溶液(423)，含量均为20 ngmL。同712和713操作，作为奶粉标准校准曲线。73测定条件731液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下：GBT 22987-2008a)色谱柱：Atlantis C183b)柱温：
14、35；c) 进样量：40弘L；d)流动相：流动相A为0见表1。5“m，150 mm21 mm(内径)或相当者1甲酸水溶液，流动相B为01甲酸乙腈溶液，梯度洗脱参考条件表1 液相色谱梯度洗脱参考条件时间rain 流速(zLmin) 流动相A 流动相B000 200 80 20300 200 50 50800 200 50 50801 200 80 201600 200 80 20732质谱参考条件质谱参考条件如下：a)离子源：电喷雾离子源(ESI)；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测(MRM)；d) 电喷雾电压(IS)：5 000 V；e) 辅助气(AUX)流速：7 Lrain；
15、f) 辅助气温度(TEM)：480；g) 聚焦电压(FP)：150 V；h)碰撞室出口电压(CxP)：11 V；i) 去簇电压(DP)：45 V；j) 四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱参数见表2。表2 四种硝基呋喃代谢物和内标衍生物的质谱参数衍生后的硝基呋哺代谢物 定性离子对 定量离子对 去簇电压 采集时间 碰撞能量及同位素内标物名称 (mz) (m) (DP)V (CE)V335291 182一Np-AMoZ335291 50 100335128 16209192 172一NP-SEM 209166 40 150209166 15249134 192一Np-AHD 249134 50 2
16、00249178 22236134 192一Np-AOZ 236134 50 100236192 172一NPDcAMoZ 340296 340296 45 100 182 NPC 5N SEM 212168 212168 45 100 152一NP_13CaAHD 252134 252134 40 100 322一NP_D。一AOZ 240i34 240134 40 100 224GBT 22987-200874液相色谱一串联质谱测定741定性确证每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与混合基质标准校准溶液中对
17、应的相对保留时间偏差在25之内且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离子丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 “相对离子丰度K K50 20K50 i0K20 K10允许最大偏差 士20 士25 士30 50742定量测定内标法定量：用仪器软件中的内标定量程序。外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对四种硝基呋喃代谢物的混合基质标准校准溶液进样测定，以混合基质标准校准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对待测样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应
18、在仪器测定的线性范围内。四种硝基呋喃代谢物及内标衍生物的多反应监测(MRM)色谱图参见附录B中的图B1。四种硝基呋喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录C中的表C1。75平行试验按试样步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验不称取样品，其余均按试样步骤进行。77回收率试验阴性样品中添加标准溶液，除不加内标溶液外，均按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算四种硝基呋喃代谢物的测定按式(1)计算：x弘会毒等筹裟式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c。基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；
19、A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；o试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；c。基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；At试样溶液中内标物的色谱峰面积；y样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。5GBT 22987-20089精密度91一般规定本标准的精密度数据是按GBT 63791和GBT 63792规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，四种硝基呋喃代谢
20、物的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程硝基呋晴代谢物的衍生物名称 添加浓度范围(ggkg) 重复性限r 再现性限R2 Np-AMOZ o2-50 lg r一0895 0 lgm 1087 4 lgR=0944 8 Igm 0711 62一NPSEM 025O lg r一1120 919m 1011 0 lgR 0978 7lg0 731 72一NPAHD 025 0 lg-r0850 2lg优一1020 5 lgR一1029 3 lg m-u0 709 52一Np-AOZ 0250 Ig r1071 0 lgm一0 885 2 lgR一0993 3 Igm 0
21、700 8注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，四种硝基呋喃代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表4。附录A(资料性附录)四种硝基呋喃及代谢物的中英名称及英文缩写GBT 22987-2008呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物的中英名称及英文缩写，见表A1。表A1 呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物的中英名称及英文缩写四种硝基呋喃 四种硝基呋哺中文名称 英文名称四种硝基呋哺代谢物中文名称 四种硝基呋哺代谢物英文名称 英文缩写5吗啉甲基3
22、氨基一2一嚼唑烷 3 amin0_5 morpholinomethybl，呋哺它酮 furaltadon AMOZ基酮 3-oxazolidin 2011e呋哺西林 氨基脲 semicarbazide SEM呋哺妥因 1氨基2内酰脲 1-aminohydantoin AHD呋哺唑酮 urazolidone 3一氨基一2一暖唑烷基酮 3-aminc一2一oxazolidlnone AoZ7GBT 22987-2008附录B(赍料性附录)多反应监测(MRM)色谱图四种硝基呋喃代谢物及内标衍生物的多反应监测(MRM)色谱图，见图B1。L ；E=：一一一0i0裂0 00 j一，一一，e1：一一ij“”
23、L。f丁了了117广r矿丌百面1而忑nL；銎；一样葚举二再砑而I=i。；!星； ； ；!雩曼冬!丝土：芸：i； ，；i萧辅i；。=：一一五一一L尝00，；，；e：一r一3 2 L等一一，r=：三一而高。；0e；L40e4 ，2520 。，。一e=：=二，而1 -1 o厂1“百r-西丁矿1面ff1百_1广西1F孑而图B1 四种硝基呋喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测(MRM)色谱图：O雠0i0ii5*旨掣避善旨单避蜃瓣嘴隧鼢；岂掣通蛋晕星督旨掣目罾15如瞻12；舱mm；15争埋型蜃黼镪旨掣目霉；3单越蛋附录C(资料性附录)回收率四种硝基呋喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表C1。GBT 22987-2008表C1 四种硝基呋喃代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据添加浓度 奶粉和牛奶样品中四种硝基呋喃代谢物的平均回收率基质样品(pgkg) 2 NPAMOZ 2 NP SEM 2 NPAHD 2 NPAOZ02 964 92 8 918 96105 912 94 7 921 935牛奶10 982 974 932 92 120 953 956 98 7 9321 6 961 912 92 4 94 740 93 5 943 98 4 974奶粉80 974 925 94 3 91 2160 914 938 92 8 943
