1、ICS 67050X 04 a目中华人民共和国国家标准GBT 2299 12008牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of virginiamycin residue in bovine milk and milk powderLCMSMS method2008-12-31发布 2009050 1实施宰瞀粥紫瓣紫糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅1”刖 昌GBT 229912008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出
2、入境检验检疫局。本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、董振霖、隋凯、赵景红、薛大芳、张华一、李振荣、庞国芳。牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2299120081范围本标准规定了原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1(virginiamycinMl)残留量测定的液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1残留量的测定。本标准的方法检出限：原料乳中维吉尼霉素M1为025腿L，纯奶粉中维吉尼霉素M1为20 pkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用
3、于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分：总则与定义(GWT 5379，1-2004，IS0 5725-1：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 63792 2004，ISO 57252：1 994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理试样中残留的维吉尼霉素
4、M1在甲醇+乙腈混合提取液中涡旋提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵缓冲溶液稀释。于c，s固相萃取柱进行净化。将洗脱液中的维吉尼霉素M1用三氯甲烷分离萃取，去除水层。氮吹三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱一串联质谱仪测定。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GBT 6682规定的一级水。41乙酸。42甲酸：色谱纯。43甲醇：色谱纯。44乙腈：色谱纯。45三氯甲烷：色谱纯。46磷酸二氢铵：优级纯。47甲酸铵：优级纯。48磷酸二氢铵溶液：01 molL，称取1150 g磷酸二氢铰(46)，用水溶解定容至1 000 mL。49磷酸二氢铵溶液：001 molL，
5、量取01 molL磷酸二氢铵溶液(48)100 mL，用水稀释定容至1 000 mL。410甲酸铵缓冲液：012 moIL，pH一32，称取756 g甲酸铵(47)，用水溶解，用甲酸(42)调节pH到32，定容至1 000mL。411甲酸铵缓冲液：0003molL，pH一32，量取250mL的甲酸铵缓冲液(410)，用水稀释定容至GBT 2299120081 000 132L。412甲醇+乙腈溶液(1+1)。413水+乙腈溶液(4+1)。414水+甲醇溶渡(13+7)。415水+甲醇溶液(9+11)。416流动相A：0003 molL甲酸铵缓冲液(411)用02 pm滤膜过滤。流动相B：甲醇+
6、乙腈溶液(1+1)(412)用02 gm滤膜过滤。417标准物质：维吉尼霉素M1(cAs：2141153一O)，纯度95。418标准储备溶液：01 mgmL。准确称取适量的维吉尼霉素M1标准物质，用甲醇配成01 mgmL的标准储备溶液。该溶液在4保存。注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量。4，19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M1的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度的标准工作溶液。标准工作溶液在4保存。5仪器51液相色谱一串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5。2离心机：最大转速为10 000 rrain。53离心管：锥形底玻璃离心管40 mL、15 mE和10 mL，具塞；
7、锥形底聚丙烯离心管50 mL具螺旋盖。54电子天平：感量01 mg和01 g。55过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：022 pm13 mm；尼龙膜过滤器：022“m47 mm。56移液器：量程为1 mL-10 mL和5 mL50 mL。5，7 微量加液器：量程为10 pL100弘L100 PL1 000 pL。5，8流动相过滤装置。59氮气浓缩仪。510高速涡流混合器。511振荡器。512酸度计：精确度为002。513超声波仪。514一次性注射器：1 mL。515固相萃取柱：Bond EIut C18，500 mg，柱长为6 mL。5，16鸡心瓶：150 mL。517贮液器：100mE。518试样瓶
8、：2 mL。519一次性移液管。520滤纸。6试样的制备与保存61试样的制备将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀。各自分出05 kg作为试样，将分出的试样密封，并作上标记。62试样保存将试样置于4条件下贮存。2GBT 2299卜一20087测定步骤71提取711原料乳样品称取原料乳500 mL，精确到00l mL，放入50 mL聚丙烯离一IL,管中，加入10 mL的甲醇+乙腈溶液(1+1)涡旋1 rain，高速振荡10 min，离心15 rain(5 000 rrain)，将上清液转移至40 mL离心管中。再向残渣中加入2 mL甲醇+乙腈溶液(1+1)涡旋5 S，高速振荡5 rain，在5 000
9、 rrain下离心10 min。合并两次上清液与40 mL离心管中。加入15 mL的001 molL磷酸二氢铵溶液(49)，高速振荡5 rain，以5 000 rrain离心10 min，用滤纸过滤至150 mL的鸡心瓶中，加入80 mL磷酸二氢铵缓冲液(49)混匀待净化。7，1，2纯奶粉样品称取纯奶粉0625 g，精确到0001 g放人50 mL聚丙烯离心管中加水4375 g，超声溶解得到复原乳。加入10 mL的甲醇+乙腈溶液(1+1)涡旋1 min，以下步骤同原料乳样品。72净化依次用5 mL乙腈、5 mL水和5 mL的磷酸二氢铵(49)洗涤活化固相萃取柱(515)。在柱上装上贮液器(51
10、7)，将样液(71)过柱，移去贮液器(517)。依次用2 mL水，10 mL水+乙腈溶液(4+1)，2 mL水和10 mL水+甲醇溶液(13+7)洗柱，弃去全部流出液。最后用5 mL水+甲醇溶液(9+11)洗涤维吉尼霉素M1，收集洗脱液到15 mL的玻璃离心管中。将10 mL三氯甲烷(45)加入洗脱液中，振荡5 rain，离心10 rain(5 000 rrain)。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10 mL离心管中，在40条件下氮吹至干。再向离心管中加入500 pL甲醇，超声5 rain，加入500 pL甲酸铵缓冲液(411)，高速涡旋5 s。样液用02 pm的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色
11、谱一串联质谱仪测定。73色谱测定731液相色谱条件液相色谱条件如下；a)色谱柱二SunFire C】g，5 Pm，150 minx2，1 ram(内径)或相当者ib)柱温：40；c) 进样量：30 pL；d)色谱柱总流量：300 pLmin；e)流动相及梯度见表1。表1流动相及梯度时间rain 流动相A 流动相B000 93 72000 40 602600 40 602800 93 73500 93 77，32质谱条件质谱条件如下：a)离子源：电喷雾离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应检测；d) 电喷雾电压(Is)：5 000 V；e)雾化气压力(CASl)：5171 kPa
12、3GBT 2299 12008f) 气帘气压力(CUR)：1034 kPa；g)辅助气压力(CAS2)：6205 kPa；h)离子源温度(TEM)：700；i) 定性离子对、定量离子对，采集时间(Dwell)，去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、入口电压(EP)，及碰撞室出口电压(CXP)见表2。表2维吉尼霉素M1的质谱参数定性离子对(mz) 定量离子对(mz) 采集时间ms 去簇电压V 碰撞气能量V 人口电压V 出口电压V5263336952633551 52633369 200 80 20 11 1552635084733液相色谱一串联质谱测定7331定性测定按照液相色谱一串联质谱测定条
13、件进行样品溶液测定。如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准中物质相一致，并且所选择的离子均出现，选择1个母离子和2个以上子离子，样品谱图中组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时提对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K50 20K50 10K20 Klo允许的最大偏差 士20 士25 30 5=507332定量测定用标准工作溶液(419)分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中维吉尼霉素M1的响应值均应在
14、仪器测定的线性范围内。在上述的色谱条件和质谱条件下，维吉尼霉素M1的参考保留时间为2428 min。维吉尼霉素M1的标准总离子流图参见附录A。维吉尼霉素M1的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B。74平行试验按照以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。75空白试验空白样品中添加标准溶液按71和72操作，测定后计算样品添加的回收率。8结果计算试样中维吉尼霉素M1残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算：xc筹揣u (1)m 1 UU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(pgkg)；c从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y样品溶液定容体积，单位为毫升(
15、mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度9，1一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的4GBT 229912008值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克样品基质 添加浓度范围 重复性限r 再现性眼R原料乳 o252oo lg ro 894 lg mo666 Ig R-2268 lg优+0273纯奶粉 2080
16、lg T-O532 lg m+0111 lgR一0685 lgm+0086注：m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。92再现性在线性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 229912008附录A(资料性附录)标准物质总离子流图维吉尼霉素M1标准物质总离子流图，见图A1。2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34tmin图A1 维吉尼霉素M1标准物质总离子流图附录B(资料性附录)回收率维吉尼霉素M1添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B1。表B1 维吉尼霉素M1添加浓度及其平均回收率的试验数据GBT 229912008样品基质 添加浓度(ggkg) 平均回收率o25 8795o50 8844原料乳1oo 92922oo 93 642o 89414o 9115纯奶粉6o 95758o 9987
