1、ICS 67050X 04 圆亘中华人民共和国国家标准GBT 232 1 82008动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定液相色谱一串联质谱法Determination of zeranol residues in animal original foodLCMs-MS method2008-12-31发布 20090601实施宰瞀髁紫瓣訾糌赘星发布中国国家标准化管理委员会及111刖 吾GBT 232182008本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本
2、标准主要起草人：方晓明、盛永刚、王敏、王传现、庞国芳。动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定液相色谱一串联质谱法GBT 2321820081范围本标准规定了动物源性食品中玉米赤霉醇(zeran01)、口一玉米赤霉醇(口一zearalan01)和玉米赤霉烷酮(zearalanone)残留量的高效液相色谱一串联质谱的测定方法。本标准适用于动物肌肉、肝脏，鱼肉、蛋和牛奶中玉米赤霉醇、p一玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量的测定。本标准方法检出限为1 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本
3、标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第1部分：总则与定义(GBT 637912004，ISO 57251：1994，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，ISO 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3原理样品经口一葡萄糖苷酸一硫酸酯复合酶
4、水解后，用乙醚提取，提取液经液液分配、HLB固相萃取柱净化后，用液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GBT 6682一级水的标准。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43无水乙醚。44三氯甲烷。45氢氧化钠。46乙酸钠(NaAc3H：0)。47磷酸：纯度大于85。48冰乙酸。49 05 molL氢氧化钠溶液：称取20 g氢氧化钠，用水溶解并定容至1 L。410 005 molL乙酸钠缓冲溶液：称取68 g乙酸钠，用950 mL水溶解，冰乙酸调节pH值至48，定容至1 I。411磷酸溶液(1+4)：10 mL磷酸和40 mL水混合。4
5、12 甲醇一水溶液(1+1)：50 mL甲醇和50 mL水混合。1GBT 232182008413口一葡萄糖苷酸酶一硫酸酯复合酶：96 000 UmL口一葡萄糖苷酸酶；390 umL硫酸酯酶(H一2，formhelix pomatia)。414玉米赤霉醇、口一玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮标准物质：纯度99。415 100 ttgmL标准储备溶液：分别准确称取适量标准品(精确至01 rag)，用乙腈溶解，配制成浓度为100 ttgmL的标准储备溶液。一18以下冷冻避光保存。416 10 ttgmL和10 ggmL的混合标准中间溶液：分别准确吸取10 mL和010 mL标准储备溶液(415)于20 m
6、L容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为10zgmL和10 pgmL混合标准中间溶液。04冷藏避光保存。417基质混合标准工作溶液：根据需要，取适量的混合标准中间溶液(416)，用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准溶液。基质混合标准工作溶液现用现配。418 Oasis HLB固相萃取柱”或相当者：500 rag6 mL。使用前分别用5 mL甲醇和5 mL水预淋洗。419滤膜：020 pm。5仪器和设备51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。52组织捣碎机。53分析天平：感量01 mg和001 g。54移液器：10 pL150 pL、loo pL1 o旺。55均质器：10
7、000 rrain。56涡旋混合器。57恒温振荡器。58离心机：4 000 rrain。59 pH计：测量精度士002 pH单位。510氮吹仪。511固相萃取装置。512具塞离心管：50 mL。513刻度试管：10 mL。6试样的制备与保存61试样的制备实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出o。5 kg作为试样。62试样保存试样置于一18冰箱，避光保存。7测定步骤71样品处理711水解称取5 g试样(精确至o，01 g)于50 mL具塞离心管中。加入10 mL乙酸钠缓冲溶液(410)和0025 mL8-葡萄糖苷酸一硫酸酯复合酶(413)，旋涡混匀，于37水浴中振荡12 h。712提取水解后加入15
8、mL无水乙醚，振荡提取5 rain后，以4 000 rrain离心2 min，将上清液转移至浓缩21)Oasis HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GBT 232182008瓶中，再用15 mL无水乙醚重复提取一次，合并上清液，40以下旋转浓缩至近干。残留物加10 mL三氯甲烷溶解后，转入10 mL离心管中，再用3 mL氢氧化钠溶液(49)润洗浓缩瓶后转移至同一离心管中，旋涡混匀，以4 000 rrain离心2min，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3mL氢氧化钠溶液
9、(49)重复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠溶液，加入1 mL磷酸溶液(411)，混匀后待净化。713净化将样品提取液(712)转入HLB固相萃取柱(418)。用5 mL水、5 mL甲醇一水溶液(412)淋洗，弃去；再用10 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2 mLmin。洗脱液在40以下用氮气吹干。残留物用1-0 mL乙腈溶解，旋涡混匀后，过02 btm滤膜，供仪器测定用。72测定条件721液相色谱参考条件a) 色谱柱：C18，2zm，50 mmX 20 ram(内径)或相当者；b)柱温：40；c) 流速：02 mLmin；d)进样量：5 pL；e) 流动相及梯度
10、洗脱条件见表1。表1流动相及梯度洗脱条件时间rain 乙腈 水0 25 755 70 306 70 309 25 75722质谱参考条件a)电离方式：电喷雾电离(ESI)；b)离子源喷雾电压(IS)：3 500 V；c) 离子源温度(TEM)：350；d)喷雾气流量：11 Lmin；e)扫描方式：负离子扫描；f) 检测方式：多反应监测(MRM)，监测条件见表2。表2多反应监测条件化合物中文名称 化合物英文名称 母离子(mz) 子离子(mz) 去簇电压v 碰撞能量V27725 160 17口玉米赤霉醇 口zearalan01 32113032 160 172772 170 16玉米赤霉醇 ze8
11、raanoI 32113032 170 1627514 170 16玉米赤霉烷酮 31913011 170 16a离子用于定量。723液相色谱一串联质谱测定7231定性测定 每种被测组分选择一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间3GBT 232 1 82008与基质混合标准工作溶液中对应物质的保留时间偏差在25之内；且样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 2050 1020 10
12、允许相对偏差 土20 士25 土30 士507232定量测定在仪器最佳工作条件下，用基质混合标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以基质混合标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，口一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见图A1、图A2和图A3。本标准的添加回收率数据参见表B1。73平行试验按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。74空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算p玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量的测定按式(1)计算：xc
13、筹揣 (1)仇 UUU式中：x试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(t,gkg)；c 从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V样品溶液定容体积，单位为毫升(mL)；m样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度91一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，重复性和再现性的值以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中口一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程
14、单位为毫克每千克样品基质 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R口一玉米赤霉醇 110 lgr=0860 6 lg优一0538 4 lgR=0873 3 lg，l O602 7猪肝 玉米赤霉醇 110 lgr-0749 3 lgm一0437 4 lgR=0792 1 lgm 0539 4玉米赤霉烷酮 110 lgr=O 878 4 19m一0458 9 lgR=0928 2 lgm一0555 6GBT 232182008袁4(续) 单位为毫克每千克样品基质 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R户玉米赤霉醇 110 lgr=0863 1 lgm一0503 0 lgR=089
15、9 1 lgm一0502 7牛肉 玉米赤霉醇 110 lgr-0885 6 lgmO431 9 lgR=0917 6 19m一0483 1玉米赤霉烷酮 110 lgr一0890 8 19m O434 8 lgR-0950 2 lgm一0515 1口玉米赤霉醇 110 lgr=0781 9 lgm一0429 5 IgR=0 805 5 lgm一0491 5鱼肉 玉米赤霉醇 110 lgr一0856119m 0 457 4 19R=0831 9 lgm一0496 1玉米赤霉烷酮 110 19r一0821 0lgm 0 429 3 19R一0866 5 19m一0481 3口一玉米赤霉醇 110 1
16、9r一0864 6lgm 0 474 0 lgR-0873 4 lgrn一0，498 8牛奶 玉米赤霉醇 l10 Igr一0712 7 lg搬一O392 4 IgR一0736 6 lgm 0468 3玉米赤霉烷酮 110 lgr 0869 4 lgm一0464 3 lgR 0833 8lgm 0480 8p一玉米赤霉醇 110 lgr=0954 0 lgm 0441 4 lgR一1003 7 lgm-0534 0鸡蛋 玉米赤霉醇 110 lgr=0 9201lgm 0501 6 lgR 0885 0 lgm一0528 6玉米赤霉烷酮 110 lgr=0 876 0lgm 0438 7 lgR-
17、0739 5 19m一0 450 9注：优为两次钡5定值的平均值。如果两次测定值的差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中p玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮的添加浓度范围及再现性方程见表4。GBT 232182008附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图p一玉米赤霉醇标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A1。图A1，一玉米赤霉醇标准物质的多反应监测(MRM)色谱图玉米赤霉醇标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A2。i028倒6登 t缒2图A2玉米赤霉醇标准物
18、质的多反应监测(MRM)色谱图rainminrain埘。避理m艇P3525150埘2。o越寝-上艇玉米赤霉烷酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图A3。“l l61划2簸m 1赶GBT 232 1 82008图A3玉米赤霉烷酮标准物质的多反应监测(MRM)色谱图tminminGBT 232182008附录B(资料性附录)回收率p一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 p一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮添加浓度及其平均回收率的试验数据样品基质 化合物名称 添加浓度(pgg) 平均回收率l 7152 756口一玉米赤霉醇5 78910 80
19、71 7082 770猪肝 玉米赤霉醇5 80410 8061 7162 78 4玉米赤霉烷酮5 76510 7941 7042 737口一玉米赤霉醇5 72910 80 91 6962 709牛肉 玉米赤霉醇5 713lO 7901 68 22 718玉米赤霉烷酮5 69610 7781 6822 721鱼肉 争玉米赤霉醇5 73410 7668表B1(续)GBT 232 1 82008样品基质 化合物名称 添加浓度(pgg) 平均回收率l 6912 742玉米赤霉醇5 72810 820鱼肉1 7312 71 4玉米赤霉烷酮5 76710 8111 7052 755口一玉米赤霉醇5 78110 8051 7052 74 l鸡蛋 玉米赤霉醇5 72 610 76 21 70o2 72 8玉米赤霉烷酮5 72210 7881 7182 731p一玉米赤霉醇5 74410 80】l 70 l2 751牛奶 玉米赤霉醇5 76210 7971 7222 739玉米赤霉烷酮5 7l 410 79 59
