1、ICS 11. 220 B 41 中华人民-=H工./、GB 和国国家标准G/T 27531-2011 病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应CRT-PCR)检测方法Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction CRT-PCR) for the pathogen of viral encephalopathy and retinopathy 2011-11-21发布2012阳03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布中华人民共和国国家标准病毒性脑病和视网膜病病原逆转录
2、-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法GB/T 27531-2011 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销唔开本880X12301/16 印张O.75 字数17千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷铃书号:155066. 1-14037定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107前言本标准按照GB/T
3、1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。G/T 27531-2011 本标准主要起草人:刘查、卢体康、何俊强、史秀杰、郑晓聪、贾鹏、叶奕优、杨锦舜。I GB/T 27531-2011 1 范围病毒性脑病和视网膜病病原逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法本标准规定了病毒性脑病和视网膜病Cviral encephalopathy and retinopathy, VER)病原分离和逆转录聚合酶链反应CRT-PCR)检测方法。本标准适用于VER病原
4、的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样3 缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE:细胞病变CcytopathiceHect) CTAB:十六烧基三甲基澳化锻Chexadecyltrimethy ammonium bromide) DEPC:焦碳酸乙二醋Cdiethypyrocarbonate) EB:漠化乙链Cethidiumbromide)
5、 EDTA:乙二胶四乙酸Cethy lenediaminetetraaceticacid) HEPES:瓷乙基呱嗦乙硫磺酸4-C2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acidJ RNA:核糖核酸Cribonucleicacid) RNasin:核酸酶抑制剂Cribonucleaseinhibitor) VER:病毒性脑病和视网膜病Cviralencephalopathy and retinopathy) 4 试剂和材料4. 1 水:符合GB/T6682中一级水的规格，用DEPC处理以除掉RNA酶。4.2 VERV病毒参考株。4.3 膜酶EDTA混
6、合消化液(见附录A中A.1)。4.4 L-15培养液(见附录A中A.2)。4.5 SSN-1细胞系:用L-15培养液25.C培养。4.6 巴11细胞系:用L-15培养液25.C培养。4.7 AMV逆转录酶:20U/rL，-20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.8 RNasin:20 U/rL, -20 .C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.9 膜蛋白酶。1 GB/T 27531-2011 4. 10 Taq酶:一20.C保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4. 11 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L. 4. 12 引物:用于RT-PCR反应的引物浓
7、度为40mol/L。其序列如下:VERV-F: 5-CGTGTCAGTCA TGTGTCGCT -3 VERV-R:5-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3 4.13 乙醇:分析纯，使用前预冷到一20.C。4.14 氯仿:分析纯。4.15 矿物油:要求元DNA酶和RNA酶，用于元热盖的PCR扩增仪。4. 16 分子量标准。5 器材和设备5. 1 96孔细胞培养板。5.2 倒置显微镜。5.3 恒温培养箱。5.4 普通冰箱和超低温冰箱。5.5 组织研磨器(研磨器处理参见附录B)。5.6 离心机和离心管(离心管处理参见附录B)。5.7 PCR扩增仪。5.8 水平电泳仪。5.9 微量移液器及吸
8、头(吸头处理参见附录B)。5. 10 紫外照射仪或凝肢成像仪。5. 11 制冰机d6 VERV的分离6. 1 采样待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm6 cm的鱼苗取头部和内脏(包括肾)，体长大于6cm的鱼取脑、眼、脾和肾。按GB/T18088的标准采样。6.2 样品处理6.2.1 组织处理用组织研磨器制备组织匀浆，按1: 10的最终稀释度用L-15培养液稀释，稀释液中含有1000IU/mL 青霉素和1000g/mL链霉素，于15.C下孵育2h4h或4.C下孵育6h24 h. 7 000 r/min离心15 min，收集上清液。6.2.2 病毒分离细胞传代使用膜酶-EDTA混合消
9、化液。对1: 10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1 : 10、1:100 ,1: 1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到两个生长约24h SSN-1或E-ll细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100L稀释液。15.C20 .C吸附0.5hl h后，加入L-15细胞培养液。两个96孔板分别置于20.C和25.C培养。设2个阳性对照(接种VERV标准株和1个空白对照(未接种病毒的细胞)。GB/T 27531-2011 阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变(CPE)，应立即进行鉴定。如果除阳性
10、对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000 r/min, 4 oC离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CPE，则应换用SSN-1或E-ll细胞和待测样品重新进行病毒学检查。7 VERV的RT-PCR检测7. 1 样晶处理将450L细胞病变悬液冻融后，放入1.5 mL的塑料离心管，再加入450LCTAB溶液(见附录A中A.3)并混匀，25oC作用2ho 7.2 核酸抽提在含有样品的塑料离心管中加入600L抽提液1(见附录A中A.的，
11、用力混合至少30So 12 000 r/min离心5，min，小心取上层水相(约800L)。再加入700L抽提液2(见附录A中A.日，用力混合至少30So 12 000 r/min离心5min，小心取上层水相(约600L)。再加入一20oC预冷的1.5倍以上体积的无水乙醇，倒置数次混匀后，-20oC 8 h以上沉淀核酸。12000 r/min离心30min, 小心倒去上清液，但j置于吸水纸上，吸干液体。37oC干燥20min或抽真空干燥;最后加10L水溶解后，作为PCR模板。7.3 变性和退火在PCR管中加入10L模板和5L引物(VERV-F和VERV-R各2.5L) ，置于70oC反应5 m
12、ino立即冰浴，低速离心约5S，使液体集中在底部。7.4 cDNA合成在上述反应管中继续加入dNTP2L、5倍逆转录酶缓冲液5L、RNA抑制剂1L、逆转录酶1L、无菌蒸馆水1.5L，低速离心后，覆盖50L矿物油。将PCR管置于PCR扩增仪。420C60 min反应制备模板的cDNA。反应结束后，700C10min灭活逆转录酶，立即冰浴。7.5 PCR扩增在上述反应管中再继续加入Taq酶1L，dNTP1L，反向引物和正向引物各1L，25mmol/L 的MgC12(见附录A中A.的10L、10倍Taq酶缓冲液(见附录A中A.7) 10L、加水到总体积100L。混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反
13、应管置于PCR扩增仪。先94oC 4 min，再开始35次循环(核酸变性94oC 1 min、引物退火58oC 1 min、延伸72oC 1 min) ，然后72oC下延伸10min，最后4 oC保温。7.6 设立对照7.6.1 在7.2中的样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。7.6.2 取含有已知VERV的病毒标准株的病鱼组织悬液作为阳性对照。7.6.3 采用未接种病毒的正常SSN-1细胞抽提核酸作为阴性对照。3 GB/T 27531-20门7.6.4 取等体积的水代替模板作为空白对照。7.7 琼脂糖电泳用TBE(见附录A中A.8)电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖(含1g
14、/mLEB，见附录A中A.的平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没肢面。将6LPCR扩增产物和2L澳酣蓝指示剂溶液(见附录A中A.I0)混匀后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5V/cm 电泳约0.5h，当澳酣蓝到达琼脂糖凝胶的底部时停止。7.8 结果判定7.8. 1 用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。如阳性对照出现一条427bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带，则表明反应体系正常。7.8.2 待测样品电泳后在相应427bp DNA位置上有带者，取PCR扩增产物进行测序，同参考序列(参见附录。进行比较，相似性达到95%以上，则判定为阳性。4
15、A.1 膜酶-EDTA混合消化液氧化铀(NaCl，分析纯)氯化饵(KCl，分析纯)磷酸二氢饵(KH2P04，分析纯)磷酸氢二饵(K2HP04，分析纯)乙二股四乙酸(EDTA，分析纯)膜酶(分析纯)双蒸水过滤除菌后分装备用。A.2 培养液附录A(规范性附录)试剂及其配制0.8 g 0.02 g 0.02 g 0.115 g 0.02 g 0.1 g 100 mL GB/T 27531-2011 L-15培养基，按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，4.C保存。开放系统使用时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol!L。A.3 CTAB溶渣按2%CTAB
16、，1.4 mol/L NaCl ,20. 0 mmol/L EDTA, 20. 0 mol!L Tris-HCl pH7. 5配制。用前加琉基乙蹲到终浓度为0.25%。A.4 抽提液1酣/氯仿/异戊醇，用1.0 mol/L pH(7. 9 :1: 0. 2)Tris饱和过的重蒸酣=氯仿=异戊醇按25: 24 : 1 的比例混合，密闭避光保存。A.5 抽提渣2氯仿/异戊醇，将氯仿和异戊醇按24: 1的比例混合，密闭避光保存。A.6 MgCl2 25.0 mmol!L。A.7 Taq酶用10倍浓缩缓冲班Tris-HCl 500. 0 mmol/L pH8. 8 5 GB/T 27531-2011
17、KCl 500. 0 mmollL TritonX-100 1 % A.8 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 棚酸54.0 g 27.5 g EDTA 2.9g 加水到1 000.0 mL 用5.0mollL的HCl调pH到8.0。A.9 EB 用水配制成10.0mg/mL的浓缩液。用时每10.0mL电泳液或琼脂中加1.0LDA.10 滇酣蓝指示剂溶液(6倍上样缓冲液)澳酣蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取煎糖25g，加双蒸水溶解后移入澳酣蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。6 GB/T 27531-2011 附录B(资料性附录)耗材去
18、RNA酶的处理方法本方法适用于本标准中所使用的研磨器、离心管和吸头。使用前于180.C干燥8h以上，或用O.l%DEPC水浸泡处理。DEPC处理时，先在37.C浸泡2h , 然后用灭菌水漂洗数次，于100c干烤15min，去除器nn.上残余的DEPC.=ON-何的hNH目。GB/T 27531-2011 附录(资料性附录)扩增产物参考序到(SJNNV基因型，GenBank接收号:D30814) C cgtgtcagtc atgtgtcgct ggagcgttcg ccttagtgtc ccgtcccttg l agacacctga ggacaccacc gctccaatta ctacccagg
19、c gccactccac 51 aacgattcca ttaacaacgg ttacactgga tttcgttcca ttctcttggg 101 ctcgacccaa ctcgacctcg ctcctgcaaa cgctgtcttt gtcactgaca 151 aaccgttgcc cattgattac aatcttggag tgggcgacgt cgaccgggcc 201 gtgtactggc acctgcagaa gaaagctgga gacactcagg tacctgctgg 251 gtactttgac tggggactgt gggatgactt taacaagaca ttcacagttg 301 gggcgcccta ctactccgac cagcaaccac ggcaaatctt gctgccggct 351 ggcacgctct tcacccgtgt tgactcg 401 侵权必究哼，4，q飞uU A斗哇牟A丛哇Z-节i. CU nhU nU Fh产D咱EA-E E-号一价书一定* 版权专有16.00元GB/T 27531-2011 打印H期:2012年2月22H F002A
