1、ICS 11. 220 B 41 中华人民圭七./、道B和国国家标准G/T 27537-20门动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程Animal influenza detection-Protocol of DNA microarray examination for influenza A virus subtypes 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/T
2、C181)归口。GB/T 27537-2011 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国人民解放军军事医学科学院、中国兽医药品监察所。本标准主要起草人:韩雪清、刘伯华、李建、林祥梅、王慧煌、刘建、陈茹、侯义宏、:x-tJ业兵、贾广乐、吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴。I GB/T 27537-2011 1 范围动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程本标准规定了A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程。本标准适用于口岸样品中A型流感病毒全部亚型(HlH16，NlN9)的筛查。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用
3、于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 缩略语下列缩略语适用于本文件。ctrl、ctr2和ctr3:质控探针1、2和3(controll、control2 and control 3) DEPC:焦碳酸二乙醋(diethylpyrocarbonate) dNTP:脱氧核昔酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) PBS:磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffer solution) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR:反转录聚合酶链反应
4、(reversetranscription polymerase chain reaction) SDS:十二皖基磺酸铀(sodiumdodecyl suHate) SSC:氯化铀/拧攘酸铀缓冲液(sodiumchloride-sodium citrate buffer) TAMRA:援基四甲基若丹明(carboxytetramethylrhodamine) 4 主要试剂和仪器4. 1 主要试剂4. 1. 1 试验用水蒸馆水，按照GB/T6682，三级用水，除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。4. 1.2 提取试剂Trizol试剂等或商品化的病毒RNA提取试剂。4.1.3 A型流感病毒多重不
5、对称RT-PCR扩增引物和探针的合成特异性引物和探针(参见附录A)。探针和引物合成后，采用元RNA酶的水(参见附录B)分别溶解为50mol，-20 .C保存备用。1 GB/T 27537-2011 4. 1. 4 RT-PCR反应试剂一步法RT-PCR缓冲液，dNTP，酶混合物，RNA酶抑制剂等。4. 1.5 基因芯片含有A型流感病毒16个HA亚型和9个NA亚型特异性探针和质控探针，参见附录Cc4. 1. 6 基因芯片杂交液商品化的基因芯片杂交液(参见附录时，每份含有ddH20O. 7L， 20 X SSC 1. 5L， 50 X Denhardt s 1. 5L，50% (质量体积比)硫酸葡
6、聚糖3.0L，4% (质量体积比)SDS 1. 5L，共8.2L/份。4. 1.7 杂交质控探针TAMRA荧光标记的一段寡核昔酸(ctr1) ，与芯片上杂交阳性参照(PC，ctr2)序列互补，用于质控杂交过程(序列参见附录A)。合成后，采用无RNA酶的水溶解为50mol/L，- 20 c保存备用。4.2 仪器n m /JJ、P/种nu 三c nUCnu 于。寸大和机、nu蒋1、冷仪器L描8硬、一高器箱盒。扫、移咐式。句浴交床片WL调轩台仪混水杂摇芯可血型卫旋温片色因箱量引微wn涡恒芯脱基冰微再nu 1234567891 ntntntntnntntntntnt aqa4au寸aqa.aa叮A峙-
7、aqa斗aq5 操作方法5. 1 采样工具下列采样工具应经(121:f:2)CC,15 min高压灭菌并烘干z棉拭子;剪刀;一慑子;1. 5 mL离心管;一一研钵。5.2 样晶采集5.2. 1 活动物取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下z一一取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次3次并旋转，取鼻腔分泌液;一一取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上顿裂来回刮2次3次并旋转，取咽喉分泌液;2 GB/T 27537-2011 一一取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便;一一将采样后的拭子分别放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL离心管中，加盖、编号。5.2.2 脏器或肌肉组织用元菌慑
8、子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。5.3 样晶贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24h 内送实验室。5.4 样晶的处理5.4. 1 棉拭子处理方法样品在混匀器上充分1昆合后，用高压灭菌慑子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入元菌的1.5 mL离心管中，编号备用。5.4.2 肌肉或组织脏器处理方法取待检样品2.0g，加入等量灭菌石英砂，于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加入10mL PBS 混匀，4.C ,3 000 r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中
9、，编号备用。5.5 样晶RNA的制备5.5.1 取上清液200L，分别加入1.5 mL离心管内，各加入Trizol试剂1.0 mL，反复混匀，冰上放置5 min。5.5.2 加人20OL氯仿，小心盖上帽盖，用力摇动离心管1臼5s，室温放置5min 5.5.3 12 0Oo r旷/min，4.C，离心1臼5min，可见分为三层，上层水相含RNA。5.5.4 转移水相至一新离心管内，加人等量异丙醇，混匀，室温放置15min. 5.5.5 12 000 r/min, 4 .C，离心10min，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言，可能看不到沉淀)。5.5.6 小心吸弃上清，加入
10、500L75%乙醇(用DEPC水配制)，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁，12 000 r/min, 4 .C，离心5min。5.5.7 小心吸弃上清，室温干燥RNA沉淀5min10 min.然后加入20L元RNA酶的水溶解沉淀。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应放置一80c冰箱保存。5.6 A型流感病毒RNA多重不对称RT-PCR扩增体系5.6.1 引物混合比例25对引物分为4组。第1组包括H1，H3，H5，H6、H7、H9，N1和N2，其中H5和H7亚型的上游引物为0.65L，下游引物为1.3L，N2亚型的上游引物为0.6L，下游引物为1.2L，其余亚型的上游引物均为0.
11、5L，下游引物均为1L;第2组包括H2，H4、H8，H10、Hll、H13、H15和H16，每个亚型的上游引物均为0.5L，下游引物均为1L;第3组包括H14、N4、N6，N7和N9，其中N7上游引物为0.65L，下游引物为1.3L，其余亚型上游引物均为0.5L，下游引物均为1L;第4组包括H12、N3，N5和N8，其中N5上游引物为o.6L，下游引物为1.2L，其余亚型上游引物均为O.5L，下游引物均为1L。5. 6. 2 RT-PCR反应体系每个样品分4个管进行RT-PCR.在0.2mL PCR反应管中依次加入一步法RT-PCR缓冲液G/T 27537-2011 10L，10 mmol/L
12、 dNTP 2.0L，酶混合物2.0L，RNA酶抑制剂0.5L，通用引物上游o.5L、下游5.0L，RNA模板5.0L，按照4组引物混合物的用量分别加入引物混合物，补元RNA酶的水至50.0L。置于PCR仪立即进行RT-PCR扩增。5. 7 A型流感病毒多重不对称RT-PCR反应条件反应条件:50.C30 min;95 .C 15 min;94.C 208,52 c 608, 72 .C 90 s，共20个循环;然后94.C208, 70.C 908，共20个循环F最后72.C延伸10min.扩增反应结束后，取出放置于4.C。5.8 基因芯片的杂交、洗涤与扫描5.8. 1 杂交步骤5. 8.
13、1. 1 扩增产物5.2L(4组RT-PCR产物各取1.3L)、杂交质控探针0.8L和杂交液6L于0.2 mL PCR管中，混匀。5. 8. 1. 2 95.C变性5min，立即冰浴3min, 4 000 r/min离心5810 8，将离心管放回冰浴。5.8. 1. 3 在杂交盒的沟槽中加入200L蒸懦水以防止杂交体系蒸发，将芯片正面向上放入盒中。5.8.1.4 将已变性的杂交样品从冰盒中取出，用枪头轻轻吹吸3次5次。5.8.1.5 取7L杂交混合液加到探针点阵区，迅速盖上盖片和杂交盒并密封。5.8. 1. 6 将杂交盒水平放入52.C的水浴锅中，杂交2.5h p 5.8.2 洗涤步骤5.8.
14、2. 1 杂交结束后，立即将芯片取出，放入预热至45.C的洗涤液I中，100r/min水平振荡洗涤5 min，相同条件重复一次。5.8.2.2 取出芯片，放人预热至45.C的洗涤液E中，100r/min水平振荡洗涤5min，相同条件重复一次。5.8.2.3 取出芯片，放入洗液田中，100r/min室温振荡5mino 5.8.2.4 将芯片在元水乙薛中浸提几次，然后把芯片放入芯片盒中，1000 r/min离心:Jmln. 5.8.3 扫描用基因芯片扫描仪(波长532nm , PMT60 % ，激光能量90%，扫描仪参数不作硬性规定)进行芯片扫描。6 结果判定6.1 检测结果成立条件A型流感病毒基
15、因芯片点样阳性参照(QC，即ctr3)和杂交阳性参照(PC，即ctr2)，经杂交扫描后出现特异性荧光信号，同时点样buffer参照(NC)和空白参照(N)无荧光信号，则检测结果成立，否则结果不成立，应重新试验。6.2 结果判断6.2. 1 阳性判定在试验结果成立的前提下，如果样品RT-PCR产物经杂交后，在各自的位置上(见图1)出现特异性4 GB/T 27537-2011 荧光信号，则判定为A型流感病毒各个亚型(包括HA和NA)核酸阳性。每条探针有2个重复位点，出现2个或2个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性;出现1个荧光信号需进行重复试验再次读判，如果仍出现1个荧光信号，就判为可疑，可采用其他
16、方法进一步验证。如果只有HA或者只有NA位点出现荧光信号，或者2个以上HA或NA亚型位点出现荧光信号，都判定为该亚型核酸阳性。QC QC Hl H2 H2 H3 H6 H6 H6 H8 H8 H9 NC NC H12 H14 H14 H14 Nl Nl N2 N5 N5 NS QC QC N8 QC一一点样阳性参照;PC-杂交阳性参照;NC一一点样buffer参照;N一一空白参照;Hl Hl H3 H3 H6 H7 H9 H9 H12 H1 2 H14 H15 N2 N2 N5 N6 N8 N9 DP(HlH16，Nl-N的一一检测探针。6.2.2 阴性判定Hl NC NC Hl H3 H4
17、H4 H4 H7 H7 H7 H7 H9 HI0 HI0 HI0 H12 PC PC H13 H15 H15 H1 5 H16 N2 N3 N3 N3 N6 N6 N6 N7 N9 NC NC N9 圄1芯片探针排布图Hl H2 H2 QC QC H4 H5 H5 H5 H5 H7 H7 H7 H8 H8 HI0 Hll Hll Hll Hll H13 H13 H13 NC NC H16 H16 H16 Nl Nl N3 N4 N4 N4 N4 N7 N7 N7 N8 N8 N9 .:f N QC QC 如果在各亚型特异性探针位置上(见图1)均未出现荧光信号，则判定为A型流感病毒亚型核酸阴性。
18、7 注意事项7. 1 样品处理、RNA提取和RT-PCR加模板等操作应该符合相关生物安全操作管理规定的要求，同时注意自身防护。扩增后芯片杂交检测可在普通实验室进行操作。7.2 因涉及RNA操作，为了防止RNA降解，用于试验的器皿和离心管、PCR管及枪头等均需要用DEPC水处理，并经过121.C、15min高压灭菌后才可使用。操作时应戴一次性手套，并经常更换。7.3 模板RNA提取、PCR反应液配制、芯片杂交、芯片洗涤和结果观察等应分区或分室进行，实验室运作应从洁净区到污染区单方向进行。7.4 当同时需要进行数个样品的多重不对称RT-PCR反应时，先配制除待检样品外的各种试剂的混合液，然后再分装
19、到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作产生的误差。7.5 使用酶?昆合物和RNA酶抑制剂等酶类时，取样之前要瞬时离心，将液体收集到反应管底部;由于酶保存液中含有50%的甘袖，带度高，应慢慢吸取以保证取样量的准确。7.6 上机运行前应检查各PCR管盖是否盖紧，以防RNA和PCR产物污染仪器。7.7 取杂交混合液加到探针点阵区时，一定要轻柔，避免出现气泡，否则会影响杂交结果。7.8 52.C杂交时，杂交盒要水平放置。7.9 芯片洗涤时，洗涤液I和洗涤液E要预热，否则洗涤不干净，影响扫描结果。7. 10 芯片常温避光保存。5 G/T
20、 27537-2011 附录A(资料性附录)引物和探针序列表A.1A型流感病毒基因芯片多量不对称RT-PCR引物型别引物编号序列(5_3)Univ- PMA-06001-uf TCACTTGCTTCCGTTGAGG ersal P如IA-06002-urTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGT H1 PMA-06003-Hlf TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAGCAATTGAGTTCAGTATC PMA-06004-H1r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGACACTCTCCTATTGTGACTG H3 PMA-06005-H3f TCACTTGCT
21、TCCGTTGAGGTGTTACCCTTATGATGTGCC PMA-06006-H3r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCCCTGTTGCCAATTTCAGAG H5 PMA-06007-H5f TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTGAATTGGAATATGGTAACTG PMA-06008-H5r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT H6 PMA-06017-H6F TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGCACTTATTGGRTCAGG PMA-06018-H6R TAMRA-GGTTTCG
22、GATGTTACAGCGTGTCCTCTAGTTTCAATCTGTGG H7 PMA-06009-H7f TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCAGGWTCTTCWTTCTATGC PMA-06010-H7r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTCYCCTTGTGCATTTTGATG H9 PMA-06011-H9f TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGAGAATGGTCCTACATCGT PMA-06012-H9r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGGATCTTACTCGCAATGTCTG N1 PMA-06013-Nlf TCACTTGCT
23、TCCGTTGAGGTCCCACTTGGAATGCAGAAC PMA-06014-N1r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACATGCACATTCAGACTCTTG N2 PMA-06015-N2f TCACTTGCTTCCGTTGAGGATAGCATGGTCCAGCTCAAG PMA-06016-N2r TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTACATGCTGAGCACTTCCTG H2 PMA-06019-H2F TCACTTGCTTCCGTTGAGGCGTCATTCTTCAGGAACATGG PMA-06020-H2R TAMRA-GGTTTCGGATG
24、TTACAGCGTGGCCTTGTTGCTATTTCWGG H4 PMA-06021-H4F TCACTTGCTTCCGTTGAGGTTGTTAYCCATTTGATGTGCC PMA-06022-H4R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTRACTCTTCCAGGGTTGTT H8 PMA-06023-H8F TCACTTGCTTCCGTTGAGGAAGGTTGGTCATACATAGTGG PMA-06024-H8R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCCTCTTACTAATGGTCTGG H10 PMA-06025-H10F TCACTTGCTTCC
25、GTTGAGGGATTGACAAGATAAGCACCGG PMA-06026-H10R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTTACTYACTCTACTAGGTGCTAT Hl1 PMA-06027-H11 F TCACTTGCTTCCGTTGAGGACTTAGAAATGTCCCAGCAA PMA-06028-H11R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCATTTCCCTCGTCTTTGGC H12 PMA-06035-H12F TCACTTGCTTCCGTTGAGGAGTACAAGAACACCAGAGATT PMA-06036-H12R TAMRA-GGTT
26、TCGGATGTTACAGCGTCTGGCCATCCGCCTTCTAT H13 PMA-06029-H13F TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACCCTTCTGCTCCTCATG PMA-06030-H13R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGAAACTGATTGATTCCCCTGG H14 PMA-06037-H14F TCACTTGCTTCCGTTGAGGTCTCCCGACTAAACTGGCTA P如IA-06038-H14RTAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCTGCCGCTCTGATTCCTTAC 6 长度601 bp 669 bp 380
27、bp 685 bp 641 bp 493 bp 328 bp 299 bp I 229 bp 324 bp 444 bp 435 bp 437 bp 537 bp 474 bp 247 bp GB/T 27537-2011 表A.1 (续)型别引物编号序列(5-3)长度H15 PMA-06031-H15F TCACTTGCTTCCGTTGAGGGACTCCTTGACTGAGATCTGG 305 bp PMA-06032-H15R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTAGTATCACATCTTTGTACCCAC Hl6 PMA-06033-H16F TCACTTGCTTCCGTT
28、GAGGTAAACTTCTCGTGCTAATCG 252 bp PMA-06034-H16R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTCTTCAACTTGATCCCTTC N3 PMA-06049-N3F TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGGAAAGARTGGATGCATGT 366 bp PMA-06050-N3R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTGTTGTTGATTCTCATCCAAGG N4 PMA-06039-N4F TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGAAGCAATCGACCATGGAT 260 bp PMA-06040-N4R TA
29、MRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCGACACCCATCCATTAGCAT N5 PMA-06051-N5F TCACTTGCTTCCGTTGAGGACTGTTATTGGGTAATGACG 459 bp PMA-06052-N5R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGCTTGTTTTGGTCCAACCG N6 PMA-06041-N6F TCACTTGCTTCCGTTGAGGACCTAATAACAATGcTTCGG PMA-06042-N6R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTCACTCTTCTATATGCTGTGC N7 PMA-06043
30、-N7F TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGTGCAGAGATAAYTGGCA 352 bp I PMA-06044-N7R T AMRA-GGTTTCGGATGTT ACAGCGTCCGGAAT AGCCTGACCAA TT N8 PMA.06045N8F TCACTTGCTTCCGTTGAGGGGGCAMTGATGTATGGATGG 340 bp PMA-06046咱N8RTAMRA GGTTTCGGATGTTACAGCGTAAGAATAGCTCCATCGTGCC N9 PMA-06047-N9F TCACTTGCTTCCGTTGAGGTTCTATGCTCTCAGCCAAGG 31
31、0 bp I PMA-06048-N9R TAMRA-GGTTTCGGATGTTACAGCGTTGGCATACGCATTCAGATTC 注:Y=(C, T) ,W=(A, T) ,R= CA ,G) 表A.2A型流感分型基因芯片探针型别编号探针序列(5-:)质控探针QCPPBA-08001-ctr1 TA沁1RA-CCTCAACGGAAGCAAGTGATPBA-OS002-ctr2 NH2-Tl5-ATCACTTGCTTCCGTTGACG PBA-08003-ctr3 NH2-GCTGCCTCGGCAAGGAGT -T AMRA H1 PBA-08004-H1a NH2-Tl5-TGCTT A
32、TGTCTCTGf AGTGTCTTC PBA-08066-Hld NH2-Tl5-AATAGAACCTGGAGACACAATAA PBA-08068-Hlf NH2-T15-CGAGAT ATTCCCCAAGACAAGTT H3 PBA-08007-H3a NH2-Tl5-CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACG PBA-08008-H3b NH2-Tl5-GGAAGCATTCCCAA TGACAAACC H5 PBA-08011-H5a NH2-Tl5-GTCACCAAT AAGGTCAACTCGATC PBA-08012-H5b NH2-Tl5-ACCAT AGCAATGAGC
33、AGGGGA H6 PBA-08025-H6a NH2-Tl5-TGAGATGTTTCCCAAAAGT ACATGG PBA-08026-H6b NH2-Tl5-ATGGGAACTGAAAGCATGAATTT H7 PBA-08013-H7a NH2-Tl5-CAGACCAAACTCT ATGGAAGTGGA PBA-080 14-H7b NH2-T15-GTCAAACACAGACAATGCTGCTT PBA-08065-H7 e NH2-T15-CAAGGAAAGACCCAGCTCTGAT AAT H9 PBA-08017-H9a NH2-T15-CAAGACGCCCAATACACAAAT
34、AAT PBA-08018-H9b NH2-T15-AAGCATGTTCAGATTCATTCT ACAG L一7 GB/T 27537-2011 表A.2(续)型别编号探针序列(5-3)Nl PBA-08019-Nla NH2-Tl5-AGTTGGTTGACAATTGGAATTTCTG PBA-08020-Nlb NH2-Tl5-CAAGAGTTGGAGGAACAACAT ACT N2 PBA-08022-N2a NH2-T15-GCGTTTGTATCAATGGAACTTGT A PBA-08023-N2b NH2-T15-ATGATGGGAAAGCATGGTTACATG H2 PBA-080
35、27-H2a NH2-T15-ACATCAACACTGAATAAGAGGTC PBA-08028-H2b NH2-T15-GAACAAAGGACACTGT ACCAGAAT H4 PBA-08029-H4a NH2-Tl5-GACAAAGGTCAACAATGGGGA PBA-08030-H4b NH2-Tl5-CTTCAACTGACGCAGAACAAA H8 PBA-08031-H8a NH2-T15-TGGAGACATCATTTTCTT ATGGG PBA-08032-H8b NH2-T15-GCATCTTACAAGAGAAT AAGGCT ATT HIO PBA-08034-HIOa NH
36、2-T15-AAAACAACTTTGTGCCTGTGGT PBA-08035-HIOb NH2-Tl5-CACAAGAAAAGAA TGATCTGT ATGG Hll PBA-08036-Hlla NH2-Tl5-CAGTGAAAT AGAGGAGAGGAT AAACC PBA-08037-Hllb NH2-T15-AGAAGGATGCT AAAGGACAATG H12 PBA-08045-H12a NH2-T15-T AA TCACAGGGAAATCACATGGC PBA-08046-H12b NH2-Tl5-CACT AGT AAGCACTATATTGGGAA H13 PBA-08038-
37、H13a NH2-Tl5-GGATGAAGATTT ACTGGTATTTGATG PBA-08039-H13b NH2-T15-GTTCATGGAGT AGGAAAT ACAACC Hl4 PBA-0804 7- H14a NH2-T15-CCATCAAGCGAT AATGAGCAAAC PBA-08048-H14b NH2-Tl5-TCTT ATGTCAGGCTCT ATCTCTGG H15 PBA-08040-H15a NH2-Tl5-GCAT ACAATTGACCTTGCAGATTC PBA-08041-H15 b NH2-Tl5-CCGATGTGACGATCAATGTATG H16 P
38、BA-08043-H16 b NH2-T15-GACAGAACATT AGACCTGCATGAT PBA-08044-H16c NH2-T15-ATCATGAGGACT ACAAAGAAGAG N3 PBA-08049-N3a NH2-T15-T ATGT AGGGACAATTGGAAGGG PBA-08050-N3b NH2-Tl5-GAT AATGATGCAAGTGCCCAGA N4 PBA-08051-N4a NH2-Tl5-GGCTATGTATGT AGTGGGAT ATTTG PBA-08052-N4 b NH2-T15-GATGGCACAGGCTCATGT AAT AG N5 PB
39、A-08053-N5a NH2-T15-GTTTGCCGAGAT AATTGGAATGG PBA-08054-N5b NH2-Tl5-AGGGAGGTCACATTGAAGAGT N6 PBA-08055-N6a NH2-Tl5-GGCAGGAAAT AT ATT AAGGACTCA PBA-08056-N6b NH2-Tl5-CCAGCT AATAACAGAGCAGAAAC N7 PBA-08057-N7a NH2-T15-ATGTTGAAAAT ACCTAATGCAGG PBA-08058-N7b NH2-Tl5-AAGGGATTCGGGTTTCT AAATGG N8 PBA-08060-N
40、8a NH2-Tl5-AGCTCCATTGTGATGTGTGG PBA-08061-N8b NH2-Tl5-AACTT AAATTGGTCAGGATACAGCG N9 PBA-08062-N9a NH2-T15-TCA TCACCACCCACAGT AT ACAA PBA-08063-N9b NH2-T15-AGAGCCAGGATGTCGAT A TGT A -一8 B.1 无RNA酶的水附录B(资料性附录)试剂配制GB/T 27537-2011 1 000 mL超纯水中加入1mL DEPC,37 .C静置1h，然后121.C高压蒸汽灭菌15min. B.2 20 x SSC 用800mL超纯
41、水溶解175.3g氧化铀和88.2g拧朦酸铀，调节pH值至7.0，定容至1000 mL 分装后121.C高压蒸汽灭菌15min. B. 3 50 X Denhardt s 50 X Denhardt s试剂的成分为:1%(质量体积比)聚糖体400，1%(质量体积比)聚乙烯毗咯炕酣和1%(质量体积比)牛血清白蛋白。B.4 50%(质量体积比)硫酸葡聚糖用900mL超纯水溶解500g硫酸葡聚糖，定容至1000 mL。B.5 4%(质量体积比)SDS用900mL超纯水溶解40g SDS，调节pH值至7.2，定容至1000mL。B.6 PBS缓冲灌B. 6.1 A灌(0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液)
42、NaH2P04 H20 27.6 g，溶于超纯水中，定容至1000 mL. B.6.2 B班(0.2mol/L磷酸氢二铀水溶液)Na2 HP04 7H20 53. 6 g(或Na2HP04 12H20 71. 6 g或Na2HP04 2H20 35. 6 g)，溶于超纯水中，定容至1000 mL。B. 6. 3 0.01 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲渣的配制0.2 mol/L A液0.2 mol/L B液NaCl 加超纯水定容至14 mL 36 mL 8.5 g 1000 mL。9 GB/T 27537-2011 B.7 洗涤液I、洗海液E、洗涤班E洗涤液1:2XSSC,0.1% SDS(
43、l7. 53 g氯化铀，8.82g拧攘酸三锅，调pH=7，用超纯水定容到1 000 mL，后加1g SDS);洗涤液II: 0.2 X SSC, O. 1 % SDSC l. 753 g氯化铀，0.882g拧棱酸三铀，调pH=7，用超纯水定容到1000 mL，后加1g SDS);洗涤液m:0. 2XSSCCl. 753 g氯化铀，0.882g拧攘酸三铀，调pH=7，用超纯水定容到1000 mL)。10 G/T 27537-2011 附录C(资料性附录)基因芯片的制备与检验C.1 芯片的设计方案本芯片设计为每张经醒基修饰的玻片上含4个点阵，每个点阵的微矩阵为14X9阵列(见图C.1) , 芯片点
44、样矩阵图包括5个部分:QC为点样阳性参照，8个重复位点;NC为点样buffer参照，8个重复位点;PC为杂交阳性参照，2个重复位点;N为空白参照，2个重复位点;其他位点为检测探针:HA亚型和NA亚型(H1H16 ，N1N9)的52条特异性探针，每条探针2个重复位点。QC一质控探针;PC一阳性探针;NC 阴性对照;N一一空白对照;QC H2 H6 H8 C H14 Nl N5 QC QC H2 H6 H8 C H14 Nl N5 QC DP一一检测探针CHI-H16，NI-N9)。C.2 芯片的制备Hl Hl Hl H1 ?飞C);L、H3 H3 H3 H3 H4 H4 H6 H6 H7 H7
45、H7 H7 H9 H9 H9 H9 HIO HIO H12 H12 H12 H12 3二(PC H14 H14 H15 H1 5 H15 H15 N2 N2 N2 N2 N3 N3 N5 N5 N6 N6 N6 N6 N8 N8 N9 N9 :-iC C 图C.l芯片点样矩阵图Hl Hl H2 H2 QC QC H4 H4 H5 H5 H5 H5 H7 H7 H7 H7 H8 H8 HIO HIO Hll Hll Hll Hll H13 H13 H13 H13 )IC ?叫(、H16 H16 H1 6 H16 Nl Nl N3 N3 N4 N4 N4 N4 N7 N7 N7 N7 N8 N8
46、N9 N9 严4. QC QC I 稀释好的探针按照芯片点样矩阵图点制到醒基基片上，即为点制好的芯片，保存期为12个月。C.3 芯片的检验从每批点制好的芯片中随机抽取2张，应为无色、透明，无缺刻，无划伤的玻璃片，对光观察能看到有明显的4个点阵。-FON|h肉的hNH阁。华人民共和国家标准动物流感检测A型流感病毒分型基因芯片检测操作规程GB/T 27537-2011 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数23千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷峰书号:155066. 1-44046 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27537-2011 打印日期:2012年2月22H F002A
