1、ICS 11.220 B 41 量昌中华人民=f:I工-、和国国家标准GB/T 27540-2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法Method of the real-time RT-PCR for the detection of classical swine fever virus 2011-11-21发布2012-03-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布目。吕本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国兽医
2、药品监察所。G/T 27540-2011 本标准主要起草人:王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启。I GB/T 27540-2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了猪瘟病毒(Classicalswine fever virus , CSFV)实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中
3、华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩暗语下列缩略语适用于本文件。CSFV:猪瘟病毒CClassicalswine fever virus) Ct值:达到阔值的循环数Ccyclethreshold) DEPC:焦碳酸二乙醋Cdiethylpyrocarbonate) HS Taq酶:热启动TaqDNA聚合酶CHSTaq DNA polymerase) RNA:核糖核酸Cribonucleicacid) 荧光RT-PCR:荧光逆转录聚合酶链式反应Creal time fluorescent quantitative reverse transcription pol
4、ymerase chain reaction) 4 试剂和材料除另有说明，所用试剂均为分析纯;所有试剂均用元RNA酶的容器分装。4. 1 Trizol: RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4.C8 .C保存。4.2 氯仿:40C预冷。4.3 异丙醇:40C预冷。4.4 75%乙醇z用新开启的元水乙醇和DEPC水配制，一200C预冷。4.5 DEPC水:去离子水中加入O.1%DEPC, 37 oC作用1h , (121土2)OC，高压灭菌15mino 4.6 RNA酶抑制剂(30UjfLL)。4. 7 10 X PCR buffer (10 mmol/L pH8. 3Tris-HC
5、l, 50 mmol/L KCl, 1. 5 mmol/L MgClz)。4. 8 dNTPC2.5 mmol/L)。4.9 用于RT-PCR反应的引物浓度为10mol/L，探针浓度为5mol/L，其序列如下:上游引物F:5-T ACAGGACAGTCGTCAGT AGTTCGA-3 GB/T 27540-2011 下游引物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3 探针P:5-FAM-CCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGA-TAMRA-3 4. 10 反转录酶:Superscript III反转录酶(200U/flL)。4.11 DNA聚合酶:HSTaq DNA聚
6、合酶(5U/L)。4.12 阴性对照:DEPC水。4. 13 强阳性对照:非感染体外转录RNA(4200 pg/L)。4. 14 弱阳性对照z非感染体外转录RNA(42 pg/L)。5 器材和设备5. 1 高速台式冷冻离心机:最大离心力12000g以上。5.2 冰箱。5.3 荧光PCR检测仪。5.4 组织匀浆器。5.5 微量移液器和吸头。5.6 离心管。6 样品的采集6. 1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本不得交叉污染。6.2 采样工具扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用3%氢氧化纳洛液浸泡消毒5min10 min , 经清水冲洗。灭菌牙签和0.5mL或1
7、.5 mL离心管经021:l:2).C，高压灭菌15minj剪、慑经160.C干烤2h. 6.3 采样方法6.3. 1 活体样晶固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至0.5mL或1.5 mL 离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按1: 5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。6.3.2 内脏样晶采取病死猪各种脏器(淋巴结、膜脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。取50mg100 mg待检样品，按1: 5倍体积加入DEPC水，于研钵或组织匀浆器中充
8、分研磨，3OOOg离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。6.3.3 4%EDTA抗凝血用无菌注射器直接全血，注入含1/104%EDTA溶液的元菌容器中，充分混匀后编号备用。2 GB/T 27540-2011 6.3.4 排泄物挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温3000g离心15min，取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转人离心管编号备用。6.3.5 细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入离心管中编号备用。6.4 存放与运送采集或处理的样品在2.C8 c条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应放置一70.C冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采
9、集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6h8 h 之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7 实时荧光RT-PCR检测7. 1 核酸提取在样本制备区进行。7. 1. 1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数重复数3+阳性管数+弱阳性管数+阴性管数，对每个离心管进行编号。7. 1. 2 每管加入500LTrizol.分别加入被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200L(由于阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染)，颠倒10次混匀，静置5min;再加入200L氯仿，混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀)。于
10、4.C、12OOOg离心15min。7. 1.3 取与7.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，加入500L异丙醇(4.C预冷)，对每个管进行编号。取7.1.2中离心后的上清液约500L(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中，颠倒混匀，一20.C静置30min. 7. 1. 4 于4.C、12000g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。7.1.5 于4.C、12000g离心10min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，弃上清，倒置于吸水纸上，沽干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。7. 1. 6
11、4 OOOg离心10s(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3min10 min. 7.1.7 加入38L经DEPC处理的水和2LRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增;若需长期保存应放置一70.C冰箱。7.2 荧光RT-PCR扩增体系的配制在反应混合物配制区进行。设PCR反应数为n，其中n为待检样品数重复数3+阳性管数+弱阳性管数十阴性管数，每个样本测试反应体系配制见表1.配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。3 GB/T
12、 27540-2011 表1每个样晶反应体系配制表体系组分用量终浓度10 X PCR Buffer 5.0L lX dNTPs l.5L 0.075mol/L 猪瘟病毒RT-PCR反应液上游引物F3.0L 0.6mol/L 下游引物R3.0L 0.6mol/L 探针溶液探针Pl.5L 0.15mol/L SuperscriptIII反转录酶0.3L 2 U/L 反应酶HS Taq DNA聚合酶0.05 U/L 0.5L 总量14.8L 7.3 加样在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入本标准7.1.7中制备的35.2LRNA溶液，盖紧管盖后，500 r/min离心30So放入
13、荧光PCR检测仪内。7.4 荧光RT-PCR扩增在检测区进行。将本标准7.3中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。循环条件设置:a) 反转录50.C/20 min; b) 预变性94.C/4 min; c) 88.C、8s , 60 .C、35s，40个循环。荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延伸时进行。7.5 结果判定7.5. 1 闺值设定试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7.5.2 质控标
14、准7.5.2. 1 阴性对照元Ct值，且元典型扩增曲线。7.5.2.2 强阳性对照的Ct值应34.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值34.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。5 FFON|oghNH阁。华人民共和国家标准猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T 27540一2011国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数11千字2012年2月第一次印刷开本880X12301/16 2012年2月第一版晤16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44040 27540-2011 打印H期:2012年2月16HF002A
