1、gB ICS 67. 100 X 04 和国国家标准iI工中华人民GB/T 22287-2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通Rl-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Detection of hepatitis a virus in shellfish Contentional RT-PCR and real-time fluorescence RT-PCR 2008-12-01实施2008-08-12发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会JF 问时伪HEJH册J悟t咐隙,adn GB/T 22287-2008 前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认
2、证认nYM任督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫)nj、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人陈广全、饶红、段淤安、冯写、付溥博、张惠援、汪琦、曾静、张睿、李金华D贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法GB/T 22287-2008 1 范围本标准规定了贝类中甲哩!肝炎病毒的普通RTPCR有l荧光RTPCR检测占一法。本标准适用二I贝类中甲型肝炎病毒核酸的检测。2 规范性引用文件F列文ft中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本
3、标准.然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否口J使用这哩文件的最新版本G凡是不注目期的14.OOpH，最小显示单位O.OlpH , 1 mVl。6.9 高速冷冻离心机(Mcckmanmodcl J2.21或其他等效设备)。GB/T 22287-2008 6. 10 微量加I样器(0.1L2L.I L 10L. 20L 100 IL.IOOL 1 OO L) IL, 1 000 ,d. 5 000 IU。6. 11 超低温冰箱(-80C)。6. 12 带滤心的无Rnasc的微量加样器吸头ClOL，100 IL, 200L.lmLl， 6. 13 元RNasc的离心饵和IPCR反应管(20L.
4、l.5 rnL, 2 mL! 6. 14 磁力搅拌器U6. 15 电子大干段小精度值。01g)。7 样品处理7. 1 样品的运输与保存样AlI至少内在1C以F的环境中进行运输。实验室接到l样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检测m将样品保存于80 C冰箱中。7.2 取样用灭商蒸恼水将贝72表面的污泥清lJt寸净，打)f贝完后，倒掉腔内的液体，使m灭商消毒的剪刀和l银子ll)贝的消化道组织、10g. B 病毒的富集10 g贝类消化进组织中j10入70mL甘氨酸缓冲液(样品质量与缓冲液体积之比为1门，组织匀浆器中充分破碎?昆匀2mina取出匀浆液30mL，置37C孵育Omino于4C.15 Og，离
5、心20min。收集上清液.加入等体积三氯ftl饶，涡旋I昆匀1rni口，安I:it放置5min. 1 700K , 4 C.离心30mina从七层液相取出15mL上tf1液，加人等体积的PEGSOOO溶液(PEG终浓度为8%).于1C过夜沉降病毒。10 00饨，1QC.离心己mmQ弃上清，保留沉淀。选择下列树种方法之一进行TNA提取。9 病毒RNA提取9.1 硅胶膜法向沉淀中加入6mol/L的异硫氨酸肌溶液1mL尽量使沉淀充分溶解，涡旋棍匀，使用Qiagcn的QIAamp Viral RN1 Mini Kit或其他等效户占1:进行RNA提取。按照厂家的试剂盒使用说明进行操作。，、GB/T 22
6、287-2008 9.2 磁珠法于沉淀中加入5mL Trizol-rcagcnt , 涡旋混匀使沉淀充分溶解。4C放置i儿转移至10mL或l mL的离心管中，力11入1.2 mL三氯甲烧，剧烈涡旋混匀1min.室温放置5min. 4 C , 12 OOOg离心;) rnm，取上清液。如l人o.倍体积异丙醇，室温放置5mino 1 C， 5 OOg离心10millo弃上消液，用75 7乙薛(4C)洗涤沉淀。1100蚀，1. oc，离心10mino弃上清液，1J1J置于吸水纸上，尽量吸F液体。3 0001(, 1 c，离心10S，将管壁上的残余液体甩到管底，用微量加样器尽量将其吸干，冰干燥5min
7、-10 mino用300，uL主i:RNA酶的水重忌iJL淀，加热至90.C，涡旋混匀使沉淀溶解。按照DynalbcaJ，oligo(dt) 2或其他等效产1111使用说明进行RA纯化。9. 3 RIi血的保存市j备好的RNA应尽快进行反转录u若暂时不能远行反转录，应予一80c保存备用c10 核酸扩增10. 1 普通RT-PCR方法10. 1. 1 Supcrscript T川onc-.tepRT PCR with platinum Taq (lnvitrogcn)i法，RT) PCR在个反应体系中一次完成，反应体系包含2X反应i昆仑物正义;)1物CNo.Pl )(10 pmol/L) 反义.
8、，1物CNo.12) (1 0 pmol/L) 25L 1L 1 L 酶混合物1 I, L 模板20L 水2I,L 反应条件:50C .30 min;911 C , 2 mno变性(4C, 3 min). 91 C电1min，!19吃.1!Ilm20 5 , 72 oC , 1 min，.10个循环g延伸(72oC ,10 mir工人注可使用其他哥效的-步法或阅*法RT-ICR检测试剂盒进行，反应体系浓度和反应条件可做相应调i.10. 1. 2 功;脂精凝胶电泳检测扩增产物11 1 X电泳缓冲液配制1.5.%的琼脂糖凝胶.在电泳槽中加入电Jj(缓冲液，使液面刚刚没过凝胶口将10liL PCR扩
9、增产物分别与适量加祥缓冲液混合，点样.5V/cmru压，电泳2日mlTI凝胶x像仪下观察电泳结果.拍照并记录结果D10. 1. 3 阳性产物的确认10. 1. 3.1 在阴、阳对照均成立的前tf，如果扩增Hl与的片段大小相符的扩增条带.可初步判断为RT PCR扩增阳性。将PCR产物用快速纯化试剂盒纯化后，连接质和一日一进行测序，并与GCTIeBank数据库中的序列进行比对。10. 1. 3. 2 使用10.2方法进行枪测和确认。10.2 实时荧光RT-PCR方法10. 2. 1 反转录反应RNA 2 IL dNTP 1L 随机引物(Omol/L)1 liL 元RNasc的去离F水6L t述混合
10、物于60c孵育5JI1lTI，放于冰l1 min后，ho入下列反应混合物10 X缓冲液2L 氯化绞CMgCl，) DTT 1 IL 2 I,L GB/T 22287-2008 Rnasc out TL l 反转录酶lL 反转录反应条件:42oC , 30 min , 7S C , 15 min , 4 C。10.2.2 实时荧光PCR反应体系2XPCR反应缓冲液反义引物CH八V2和HAV3均10pmol/L) 正义引物CHAVl) (10 pmol/I,L) 探针(0 pmol/ vL) cD:lA 加灭菌去离子水至实时荧光RTPCR反应参数50 oC.2 min;9S C ,10 min;9
11、5 C , 15 s.60 C.1 min，50个循环。2L 4. 5LCHAV2和H八V3等体积，共1.5vL) 1. IL 1. 2L 2L 50 IL 注r可使用其他等效的一步法或两步法RTPCR检测试剂盒进行，反应体系浓度和丘向条件时做相庇调整。11 质量控制11. 1 阳们对照:将100个TCIo豹甲肝疫苗添加于10g已知的性贝类消化道组织巾，与待检样品进行相同的处理.阳性对照的目的是测试样品巾的楼酸是否被有效的提取出来。如果阳性对照出现阴性结果，说Ii)H内毒R:-.IA提取失败，应重新对样品进行检测.11. 2 阴性对照z取已知的阴性贝类消化道组织10g.与待楼样品进行和11叶的
12、处理。去阴性对照出现阳性结果，可能足试剂、反!但体系有污染，bj查找原因，重新进行检测.11. 3 试开IJ宅自对照进1i普通PCR及实时尖光氏、R需设立试剂对照，以检测P(丁R反应混合物中足否在也污染。若试并l空白对照出现阳性结果，应换试剂后重新进h检测。12 结果判断及表述12. 1 结果判断12. 1. 1 普通RT-PCR方法12. 1.1. 1 对待测样品进行RT一PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现条持，阳性对照出现预期大小的扩士曾条带.r的样品禾iJJ现预期大小的扩增条带，则可判定样品甲型肝炎病毒核酸检测阴性。12. 1.1. 2 如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和
13、样品出现预期大小的扩增条带，并且对PCR 产物序列分析证实与甲型肝炎病毒序列致，则可判断样MIfJ型肝炎病毒核酸检测阳性;若两者序列不-致，则f判断样品甲型肝炎病毒核酸检扭rJ阴性。12. 1. 2 实时荧光RT-PCR方法待检样品的Ct值二三13时，则判断为甲型肝炎病毒核酸检测阴性。待检样品的Ct值10时，则判断为甲型肝炎病毒核酸检测阳性。待检样品的10Ct值13时，所重新进行检测。若重新检测的Ct值二三13时，则判断甲型肝炎病毒核酸检测阴性。若重新检测的40三Ct值43时，贝IJ判断Ijl型肝炎病毒核酸检测阳性。12.2 结果表述甲型肝炎病毒核酸检测阳性/g肠道组织u甲型肝炎病毒核酸检测阴
14、性/5g肠道组织。13 安全13. 1 实验室安全防护按GB19489中的规定执行。13.2 实验中使用的焦碳酸二乙醋、澳化乙链具有致癌作用，应戴乳胶或PE子套进行操作D焦碳酸二J GB/T 22287-2008 乙醋具有挥发性，应在通风街或通风良好的环境巾自己制和使用;所有使用过的器皿应于121C高压3 0 min后再进行清洗。Trizol-rcagcnt对皮肤具有极强的腐蚀性，操作时应戴乳胶于套。13.3 实验中产生的废弃物和器皿(除配制焦碳酸二乙醋的器皿外)应1121 C高压20min后再丢弃或进行清洗口13.4 操作气氯甲:皖、异时醉时应佩戴次性于套并在通风橱或通风良好的环境中配制和使
15、用。14 防污染措施拎出1过程中防污染措施按照S:l/T1193巾的规定执行。6 A.1 普通溶液的配制附录A规范性附录)溶液的配制A. 1. 1 甘氨酸缓冲液:含O.1 moliL忖氨酸.0.3mol!L NaCI , pH9. 5 甘氨酸(优级纯)1.5 g 氧化纳CaCIl去离子水5 mol/L氢氧化纳溶液(NaOHl17.5 g 800 mL 调pH至9.5GB/T 22287-2008 力11去离子水至1000mL, 121 C , 15 min灭前备用。此溶液可于4C保存9个月。A. 1. 2 PEG8000溶液吉16%(质量浓度)PEG8000 ,0.525 mol/L NaCI
16、 PEG 8000 (tJt级纯)16 g 氯化纳(NaC)3.07 g 加去高f水至100mL，于磁力搅拌器上混匀后，121C, 15 min火雨备用。此溶液ri 1 C保存9个月。A. 1. 3 50XTAE缓冲液A. 1. 3.1 0.5 mol/L ELlT/-:-ia，C乙二饺四乙酸t销)溶敲，pH8.0EDTA-a， H,() (前去离F水5 mol/L氮氧化轨浴被1且6.1 g 800 mL 调pH至8.0;反两去禹r7(却至1OO (J mL, 121 C, 1;) min火雨备用.A. 1. 3. 2 TAE电泳缓冲液。OX)配制起基甲基氨基甲虫完(Trisl 冰乙酸242
17、g 57.1 mL 口.5ml/L EDT八溶液，pH8.0100mL 灭前去离子水加歪1000mL. 121 C , 15 min灭商备用。用时用灭前去离F水稀释至L使1Il.A. 1. 4 1阜化乙绽(EIl)溶液(10g/f-Ll澳化乙绽20 mg j(南去离子水20皿LA. 1. 5 含o.g/mL 澳化乙绽的1.5%琼脂糖凝胶的回市l琼脂糖1.5日1 X T/E电泳缓冲液加至100mL 混合后加热至完全融化，待冷至50C 5i C时，加澳化乙筷(EBl溶液511L.轻轻晃动摇匀.避免产生气泡噜将梳子置入电泳槽中，然后将琼脂糖溶液倒入电泳板上，待凝同民(需约40min)，取下梳子备用。
18、A. 1. 6 10 X加样缓冲液，聚w糖灭南去离子水澳盼蓝25 g 100 mL 。1g 7 GBjT 22287-2008 二甲苯青。1g A.2 RNase的去除和无R:Iiase溶液的配制配置溶液用的酒精、异内醇、Tris，EDTA、LiCl、:-.raOH等应采用未开封的新品。配制溶液所用的去离子水、玻璃容器、微量加样器吸头、药勺等塑料lfJ具应无RNasc，操作过程中应白始至终戴一次性橡胶或乳胶于套，并经常更换，以避免将皮肤上的细雨和真商以及人体自身分泌的RNA酶污染m具或带入溶液。A. 2.1 玻璃容器应在240C烘烤1h以去除RNascoA. 2. 2 离心管、微量加样器吸头、
19、药人J等塑料用具应Jj口.1%的DEPC(焦碳酸一二乙酶水室温浸泡过，然后灭菌，烘干，或直接购买元RNasc的相应规格离心管、微量加样器吸头。A.2.3 元RNas巳去离子水去离子水100 mL 焦碳酸-乙醋(DEPC)50L 温过夜，121oC , 15 min灭菌，或直接购买元RNasc去离子水。A.2.4 75%乙醇无水乙醉主二RNasc去离子水现用现配u7.5 mL 2.5 mL A. 2. 5 1 X R)I A吸附缓冲;在(Tris，LiCl，EDTA-)Ia， H，O为优级纯)A. 2. 5.1 1 mo/L Tris- HCl pH7. 5 Tris 1. 21 g 6 mL
20、元RN川去离子水36.5%盐酸。.75mL 1 mol/L盐版调pH至7.5力II:JCRNc去离子水至10mL，分装1111. 5 rnL :兀RNasc离心管巾，-20 C保存。A. 2. 5. 2 0.5 mol/L EDTA-Na, (乙一绞肉乙酸二纳)，pH7.5EDTA-Na,. !, O 1. 86 g 尤RNasc去离子水6 mL 10 mol/L氢氧化纳溶液调pH至7.5加元R:-.rasc去离子水至10mL，分装到1.S mL无RNasc离心管巾，-20C保汗口A. 2. 5. 3 5 mol/L LiCl LiCl 无RNa，刊去离f水2. 12 g 8 mL 加元R:-
21、.ra出去离子水至10mL，分装到1.5 mL无RNasc离心管中，-20 C保存。A.2.5.41XRNA吸附缓冲液:含20mmol/L Tris-HCl (pH 7日，1.0 mol/L LiCl , 2 mmol/L EDTA-Na, , pH 7.5 1 mol/L Tris HCl 5 mol/L LiCl 0.5 mol/L EDTA-Na, (pIl 7.5) 元RNa，:;c去向于一水总体积现配现用。200 IL 2 000L 10 I,L 7 760L 10 mL A. 2. 6 2 X RNA吸附缓冲液(丁ris，LiCl , EDTA-:la, H，O为优级纯)含10mm
22、ol/L Tris-HCl 8 (pH 7.5) .2. 0 mol/L LiC l.1 mmol!L EDT.Nn, , pH 7.5 1 mol/L Tris.HCI 5 mol/L LiCI 0.5 mol/L EDT.Na, (pH 7.5) 无RNasc去离子水总体积现自己现用。100L 1 ()OO rL 80L 5 520L 10 mL GB/T 22287-2008 A. 2. 7 洗涤缓冲液(T1S，LiCI , EDTA-Na, l-l，O为优级纯)，含10mmol/L Tris.HCI (pH 7.5) , 。.15mol/L Li Cl, 1 mmol/L EDTA.N
23、岛.pH7.5 1 mol/L Tris.HCI 100L 5 mo/L LiCI 300L 0.5 mol/L EDTA-Na, (pH 7.5) 元R=Jasc去离子水总体积现院现用。20L 9 580L 10 rnL 9 GB/T 22287-2008 参考文献1J Costa Mattioli, M. ,ct a1. (2002). Quantification and duration of viraemia during hepatitis A inlcction as dctcrmincd by real-time RT-PCR. J. Viral Hcpatitis. 9 ,1
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25、5: 177 182 4 J Narayanan othikumar, ct al. (2005). Rapid and sensitivc dctcction of Noroviruscs by using TaqMan-bascd Onc Stcp Rcversc Transcription-PCR assays and application to naturally con taminated shcllfish samplcs. App1. E口viron.Microbiol. rH: 1870-1875 5J Y. -S. Carol shich , ct a1. Cl 999)A
26、 mcthod to dctect low lcvcls 01 cnt盯1CVlruscs 10 can taminatcd oystcrsLJ J. App1. Environ. Microbio1. 709-711 L6J Alissa B. Dix, Lcc-ann Jaykus. (1 998). Virio口conccntrationmcthod for thc detcction of human cntcric viruscs i口cxtractsof hard-shcllcd clams. J. Food Protcction. 1: 158-165 10 OON|hNNNH凶。共国家标准贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-ICR方法和实时荧光RTPCR方法(;B/T 22287 国有lL 人， 叫?2008 中国标准出版祉出版发行北京宣兴门夕!二里河北街16号邮政编码l)15 4峰间址电话6852:1946中国标准出版社秦皇岛印刷1印刷各地新华书店经销68517548 印张1字数19千字2008年10月第次印刷1/16 开丰880X 1230 2008年10月第 今版11 :n:; 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权，究举报电话，(010)68533533定价16.00书号1.J5066 1 31 LlU 1111
