1、ICS 11. 220 B 41 毒草3中华人民=H二.、和国国家标准GB/T 27634-2011 传染性囊病病毒核酸检测方法Protocol of nucleic acid detection for infectious bursal disease (gumboro disease) virus 2011-12-30发布2012-04-01实施数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会发布G/T 27634-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SACjTC181)归口。本标准起草单位z中华
2、人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业大学、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、北京盈九思科技有限公司。本标准主要起草人z秦智锋、孙洁、卢体康、花群义、陈书璀、吕建强、杨素、方兴旺、曾少灵、詹爱军、毕英佐、陈兵、阮周曦、朱玉兰。I G/T 27634-2011 传染性囊病病毒核酸检测方法1 范围本标准规定了传染性囊病病毒RT-PCR检测方法和实时荧光RT-PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于传染性囊病病毒感染的快速诊断。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB 19489实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数。IBD: infectious bursal disease，传染性囊病。IBDV : infectious bursal disease virus，传染性囊病病毒。SPF: specific pathogen free，元特定病原体。4 材料与试剂4. 1 仪器与耗材4. 1. 1 核酸电泳仪。4. 1. 2 凝胶成像仪。4. 1. 3 冷冻离心机
4、(最高离心力达15OOOg以上)。4.1.4 混匀器。4. 1. 5 冰箱(2oC8 oC，一20oC , -80 oC)。4. 1. 6 微量可调移液器(10L，100L，l000L)。4. 1. 7 微量带滤芯吸嘴(10L，100L，l000L)。4. 1. 8 灭菌研钵。4. 1. 9 离心管。4. 1. 10 PCR光学反应管。4. 1. 11 PCR仪。4. 1. 12 实时荧光PCR仪。1 GB/T 27634-2011 4.2 试剂4.2.1 试剂级别z除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。4.2.2 引物与探针z采用无DNA酶、元
5、RNA酶水将每条引物与探针配制成100Ilmol/L储存液，置一20.C或更低温度冻存;使用时取适量配制成10mol/L工作液，避免多次冻融。4.2.3 灭菌双蒸水。4.2.4 三氯甲烧。4.2.5 异丙醇。4.2.6 元水乙醇。4.2.7 75%乙醇:用新开启的灭菌双蒸水配制，一20.C预冷。4.2. 8 DL2000 DNA Marker。4.2.9 一步法RT-PCR检测试剂盒。4.2. 10 一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。5 生物安全要求5. 1 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489的有关规定。5.2 IBDV核酸检测方法的实验室规范(参见附录A)。6
6、 样晶的采集6. 1 按照GB/T18088的要求进行样品的采集。6.2 样品包括各种病料、用于IBDV监测和检测的禽组织、IBDV的细胞培养液、IBDV接种鸡胚的尿囊液等。7 核酸抽提7. 1 酣三氯甲皖抽提法7. 1. 1 取灭菌的1.5 mL离心管，做好标识。7. 1. 2 每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照(SPF鸡的法氏囊组织PBS研磨上清液)、阳性对照(标准的IBDV毒株)各200L，再加入200L三氯甲烧，混匀器上振荡混匀5s，于4.C 12 OOOg离心15min. 7. 1. 3 取无RNA酶的1.5 mL离心管，加入一20.C预冷400L异丙醇，吸取本标准7
7、.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。7. 1. 4 于4.C 12 OOOg离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体;加入600L75%预冷乙晖，洗涤。7. 1. 5 于4.C 12 OOOg离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。7. 1. 6 10000g离心10s，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min10 min. 7. 1. 7 加入15L元核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000g离心5s，冰上保存备用。若需长期保存应放置一70.C冰箱。GB/T 27634-2011 7.2 其他核酸抽提法核酸提取可以采用等效RNA提取试剂及方法，
8、如采用自动化核酸抽提工作站来抽提核酸。8 RT-PCR检测8. 1 引物8. 1. 1 针对A片段VP2基因的引物上游U3:5-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3下游L3: 5 -CAG-GAA-ACA-GCT-AT(岳ACC-GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3 8.1.2 针对B片段VP1基因的引物上游+290:5-TGT-AAA-H;GCC-AGT-GAA习寸C-AGA-l寸C-TGC-AGC-CACJT-CTT-3 下游-861: 5 -CAG-GAA-ACA-GC
9、T-且巳-AI-CTG-CAG-l丁G-ATG-ACT-TGA-JT-TGA-T丁寸:1G-38. 1. 3 引物组成的说明8. 1. 3. 1 通用引物M13或R13(黑体部分)序列。M13或R13序列为多数测序反应中的测序引物，便于对PCR扩增产物测序。8. 1. 3. 2 限制性内切酶位点(下划线部分)。限制性内切酶位点的引人，使得IBDV经RT-PCR扩增后的产物可用限制性内切酶SphI(引物U3)、EcoRI(引物L3和十290)、PstI(引物-861)进行酶切后加入质粒中。引物U3和L3分别对应AccNo X84034毒株序列片段A的657-676和1193-1212位置，引物十
10、226和一793分别对应AccNo AF240687毒株序列片段B中的290-311和861-883位置。8. 1.3.3 IBDV特异性序列(斜体部分LA片段扩增产物为604坤，B片段扩增产物为642忡，引物扩增片段适合进行IBDV分子分析和分子流行病学研究。8.2 反应液的配制按照商业化的一步法RT-PCR试剂盒推荐说明书，进行IBDVRT-PCR反应液的配制(参见附录助。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。8.3 加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸5L，混匀后瞬时离心，将PCR管放入PCR检测仪内，记录样本放置顺序。8.4 PCR
11、扩增检测8.4. 1 在扩增检测区进行。8.4.2 PCR反应条件为:第一步:反转录50.C45 min; 第二步:94.C5 min(如果为热启动一步法RT-PCR试剂盒，则需要95.C 15 min); 第三步:94 .C 30 s , 54 .C 45 s , 72 .C 1 min 30 s , 5个循环;第四步:94.C30 s , 64 .C 45 s , 72 .C 1 min 30 s，30个循环;第五步:72.C延伸10min。3 GB/T 27634-2011 8.5 上样和电泳配制凝胶(见附录C)。将样品的扩增产物按编号加入对应的1%琼脂糖凝肢的各孔中，其中一个上样孔中加
12、人标准阳性对照扩增产物，一个上样孔中加入标准阴性对照扩增产物。在凝肢的边孔中加入标准分子质量的DNAMarkero将凝胶在80V恒定电压下电泳60min。将凝胶置紫外灯或凝胶成像仪中进行检查。8.6 结果判定8.6.1 阳性出现一条分子质量为604bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段A核酸阳性。出现一条分子质量为642bp条带，与阳性对照PCR产物同步迁移的大小相同条带，判为IBDV片段B核酸阳性。片段A和片段B同时出现核酸阳性，可以判定IBDV阳性。8.6.2 阴性片段A和片段B同时出现核酸阴性，IBDV判为阴性。8.6.3 可疑在片段A和片段B的核酸检测中
13、，只出现其中一个片段为阳性，另一个片段为阴性，则判定为IBDV可疑。结果可疑应进行实时荧光RT-PCR检测;或重复进行RT-PCR检测，出现A和B两个片段中任何一个片段判定为阳性，否则判定为阴性。9 实时荧光RT-PCR检测9. 1 引物和探针9. 1. 1 针对A片段VP2基因的引物上游引物:5TTCATACGGAGCCTTCTGAT 3; 下游引物:5ACAATTAGCCCTGACCCT 3。9. 1. 2 TaqMan探针:5FAM-CAACCGGACCGGCGTCCATTC-BHQ3，其5端和3端分别标记FAM和BHQo9.2 扩增检测9.2.1 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。按
14、照商业化的一步法实时荧光RT-PCR(realtime RT-PCR)试剂盒推荐说明书，进行IBDVreal time RT-PCR反应液的配制(参见附录D)。将配制的每个PCR反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。9.2.2 加样在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸5L，混匀后瞬时离心，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。9.2.3 PCR扩增检测(扩增检测区)9.2.3. 1 反应条件设定第一步:反转录45oC 30 min; 4 GB/T 27634-2011 第二步:热启动95.C 15 min(不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书
15、进行); 第三步:95.C15 s , 60 .C 45 s，40个循环，60.C时设置采集荧光。9.2.3.2 荧光素设定报告荧光(reportdye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定)，浑灭荧光(quenchdye) 设定为None，校准荧光(referencedye)设定为No肘。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9.3 分析条件设定和结果判定9.3.1 阐值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阔值(threshold)设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择FAM通
16、道进行分析。9.3.2 质控阴性对照应元Ct值，阳性对照的Ct值应30，且呈现S型典型扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。9.3.3 荧光PCR结果分析及判定9.3.3. 1 阳性反应结果判定在试验成立的条件下，检测结果呈现Ct值35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应，表明IBDV核酸阳性。9.3.3.2 阴性反应结果判定检测结果呈现元Ct值、元扩增曲线或反应曲线元明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，表明IBDV核酸阴性。9.3.3.3 可疑反应结果判定检测结果35Ct值40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑
17、阳性，否则判为阴性。9.3.3.4 可疑样品处理对于可疑阳性样品，应重新抽提核酸，再次进行IBDVreal time RT-PCR检测。如果重复检测的Ct值40，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应，表明IBDV核酸阳性。否则判为荧光PCR阴性反应。5 GB/T 27634-2011 附录A(资料性附录)mnv核酸检测方法的实验室规范A.1 实验室设置要求A. 1. 1 实验室分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、PCR反应混合物配制区和检测区，并且明确标识。A. 1.2 每一区域应有专用的仪器设备，并且明确标识。A. 1. 3 进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、P
18、CR反应混合物配制区至检测区。A. 1.4 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，工作服不能穿离各特定区域。A. 1.5 实验室清洁时应按PCR反应混合物配制区、样本制备区至检测区的顺序进行。A. 1.6 不同的实验区域应有其各自的清洁用具，以防止交叉污染。A.2 工作区域仪器设备配置A. 2.1 样本制备区仪器设备配置2 .C8 .C冰箱;一20.C冰箱;冰冻台式离心机(注12OOOg) ;11昆匀器;微量加样器(0.5L10L，5L20L，20L200L，200Ll 000L) ;可移动紫外灯。A.2.2 PCR反应混合物配制区2.C8.C冰箱;- 20 .C冰箱;台式离
19、心机(注3OOOg);混匀器;微量加样器(0.5L10L， 5L20L，20L200L，200Ll 000L) ;可移动紫外灯。A.2.3 检测区仪器设备配置荧光PCR仪E可移动紫外灯z打印机。A.3 各工作区域功能及注意事项A. 3.1 样本制备区A. 3. 1. 1 标本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行。A. 3.1.2 可在本区内设立正压条件以避免邻近区的气溶胶进入本区造成污染。A. 3. 1. 3 用过的加样器吸头应放入专门的消毒(例如含次氯酸纳溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料(原始样本、提取过程中样本与试剂的混合液等)如出现外溅，应作
20、清洁处理并作出记录。A. 3. 1. 4 对实验台适当的紫外照射(254nm波长，与工作台面近距离)可以帮助灭活病毒和消除核酸的污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射。A.3.2 PCR反应混合物配制区A. 3. 2.1 试剂的分装和反应混合液的制备在本区进行。GB/T 27634-2011 A.3.2.2 在整个本区的实验操作过程中，操作者应戴手套。工作结束后应立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸铀等的化学物质的消毒清洁作用。A.3.3 检测区A. 3. 3.1 在本区进行荧光PCR检测。A. 3. 3. 2 PCR扩增产物不能在本实验室开盖，PCR
21、管应抛弃在远离本实验室的垃圾箱中。A. 3. 3.3 实验完成后采用紫外灯对实验室进行充分照射。7 GB/T 27634-2011 附录B(资料性附录)IBDV RT-PCR反应液的配制每份检测样品的IBDVRT-PCR体系(50L)如表B.l。表B.1 组分体积L 元核酸降解酶的水20 10XOne step RNA PCR Buffer 5 MgC12 (25 mmol/L) 10 dNTP Mixture(各10mmol/ 5 上游引物(20mol/mL)1 下游引物(20mol/mL)1 RNase Inhibitor(40 U/L) 1 AMV RTase XL(5 U/L) 1 A
22、MV-Optimized Taq(5 U/L) 1 总体积45 注:不同公司生产的onestep RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修改。8 C. 1 琼脂糖凝肢的TAE缓冲液(50x) 附录C(规范性附录)电泳缓冲液的配制三是甲基氨基甲烧碱(Tris-base)242 g O. 5 mol!L(pH8. 0)乙二胶四乙酸(Na2EDTA 2H20) 100 mL 冰乙酸57.1 mL 蒸锢水700 mL 待上述混合物完全溶解后，加蒸馆水至1000 mL，至40C冰箱中备用。GB/T 27634-2011 如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馆水稀释50
23、倍成TAE缓冲液。C.2 1%琼脂糖凝胶植制备取0.5g琼脂糖加入50mL 1XTAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，冷却至60oC后，加入3L 10 mg/mL澳化乙链，倒入凝胶板中，插入梳子，待凝胶完全凝固后拔去梳子，备用。9 GB/T 27634-2011 附录D(资料性附录IBDV real time RT-PCR反应液的配制每份检测样品的IBDVreal time RT-PCR体系(25L)如表D.L表D.1组分体积L 2XRT-PCR Buffer 12.5 Enzyme Mix 1. 0 上游引物(10mol/mL)1. 0 下游引物。mol/mL)1. 0 TaqMan探针。m
24、ol/mL)1. 0 元核酸降解酶的水3.5 总体积20 注2不同公司生产的realtime one step RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，可根据相应的说明书进行修改。10 -FON|寸的hNH阁。华人民共和国家标准传染性囊病病毒核酸栓测方法GB/T 27634-2011 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数21千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷* 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-44348定价GB/T 27634-2011 打印H期:2012年3月30R F002A
