1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 27521-2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法RT-PCR assay for swine influenza virus nucIeic acid 2011-11-21发布数码防伪 中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。GB/T 27521-20门本标准起草单位z中国农业科学院晗尔滨兽医研究所，中国检验检疫科学
2、研究院，中国兽医药品监察所。本标准主要起草人z乔传玲、韩雪清、杨焕良、刘业兵、陈艳、吴绍强、陈化兰、林祥梅、辛晓光、朱中武、王慧煌、刘建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、宁宜宝、薄清如、秦智锋、林志雄。I GB/T 27521-2011 猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法范围本标准规定了猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法的技术要求。本标准规定的RT-PCR检测方法适用于检测猪肺脏组织、鼻腔及气管分泌物和这些采集样品培养物中的猪流感病毒核酸。2 缩略语下列缩略语适用于本文件。DEPC:焦碳酸二乙醋Cdiethypyrocarbonate)dNTP:脱氧核昔酸三磷酸Cdeoxy-ribonucl
3、eosidetriphosphate) EB:漠化乙链Cethidiumbromide) M-MLV RT:莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶Cmoloney murine leukemia virus reverse tran-scriptase) PCR:聚合酶链式反应Cpolymerasechain reaction) RNA:核糖核酸Cribonucleicacid) RNAase inhibitor:RNA酶抑制剂RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应Creverse-transcriptionpolymerase chain reaction) SPF:无特定病原体Cspecificpat
4、hogen free) Taq DNA polymerase: Taq DNA聚合酶3 仪器3.1 PCR仪。3.2 台式低温高速离心机。3.3 电泳仪。3.4 电泳槽。3.5 冰箱。3.6 凝胶成像系统。3. 7 微量移液器。3.8 水浴锅。4 试剂4. 1 LS TRlzol RNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。4.2 氯仿、异丙醇、元水乙醇。4.3 1.2%琼脂糖凝肢，见附录A中A.IQ4.4 50XTAE缓冲液，见附录A中A.2。1 GB/T 27521-2011 4.5 漠化乙键CEB，10g/L)或核酸染料，见附录A中A.304.6 焦碳酸二乙醋CDEPC)处理的灭菌双蒸水
5、，见附录A中A.404.7 DNA分子量标准(100bp)。4.8 M-MLV反转录酶。4.9 RNA酶抑制剂。4.10 Taq DNA聚合酶04.11 dNTP。4. 12 商品化的一步法RT-PCR反应试剂。含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。5 引物5. 1 反转录引物见附录B中B.L引物浓度为20pmol/L。5.2 PCR引物见附录B中B.20引物浓度均为20pmol/L。6 样晶对照以灭活的猪流感病毒感染SPF鸡胚尿囊液或者感染动物的组织作为阳性对照，以正常SPF鸡胚尿囊液或者正常动物组织作为阴性对照。7 操作步骤7. 1 样晶的采集及处理7. 1.
6、 1 采样工具下列采样工具应经121.C :I: 2 oC ,15 min高压灭菌并烘干:a) 棉拭子;b) 剪刀;c) 慑子;d) 1. 5 mL离心管;e) 研钵。7. 1. 2 活猪取鼻拭子。采集方法如下:将棉拭子深入鼻腔旋转，取鼻腔分泌液;将采样后的拭子分别放入盛有1. 0 mL PBSC见附录A中A.5)的1.5 mL离心管中，加盖、编号。7. 1. 3 病死猪取肺脏或气管分泌物等。采集方法如下:用元菌慑子和剪刀采集肺脏等，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。7. 1. 4 样晶贮运样品采集后，放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24h 内送实
7、验室。GB/T 27521-2011 7. 1. 5 样晶处理7. 1. 5.1 棉拭子处理方法样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌慑子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，室温静置30min , 4 .C、3000 r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。7. 1. 5.2 脏器处理方法将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中，按质量体积比(1:1)加人样品保存液进行充分研磨;4.C、3000 r/min离心15min，取上清液转人元菌的1.5 mL离心管中，编号备用。7.2 RNA的提取7.2.1 用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的
8、RNA。7.2.2 250L样品处理液和750LLS TRIzol置入一个1.5 mL离心管，振荡数次，静置5min。7.2.3 加200L氯仿，振荡混匀，室温放置5min ,4 .C 12 000 r/min，离心15min。7.2.4 吸取上层水相至一新离心管中，加人等量异丙醇，混匀，室温放置15min ,4 .C、12000 r/min离心15min，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀(对于细胞毒而言，可能看不到沉淀)。弃上清。7.2.5 小心吸弃上清，加人50OL7而5%乙醇(DEPC水配置)，小心颠倒以漂洗洗;沉淀及管壁，4.C、12 0Oo r旷/min，离心5m口l山i让
9、III7.2.6 小心吸弃上清，沉淀置室温条件下干燥后，加适量DEPCz水k溶解。7.2.7 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须放置一70.C冰箱保存。7.2.8 也可采用商品化的基因组RNA提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴、阳性对照样品RNA的提取。7.3 RT-PCR 7.3. 1 一步法反应操作步骤(如实验室有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤)7.3. 1. 1 在0.2mL反应管中依次加入:一步法RT击PCR缓冲液dNTP( 1 0 mmol/L) 酶混合物RNA酶抑制剂上游引物下游引物RNA模板10L 2.0L 2.0L 0.5L 0
10、.5 mL 0.5L 5L DEPC水29.5L上述体系根据扩增目的片段不同，分别选择相应的M、H1HA、甲H1HA、H3HA、N1NA及N2NA单个基因的上/下游引物进行反应。7.3. 1. 2 采用PCR仪立即进行RT-PCR扩增。检测同时设立阴、阳性对照。7.3. 1.3 RT-PCR反应条件为:48.C 45 min;94 .C 2 min;然后94.C30 s , 50 .C 1 min , 68 .C 2 min, 共40个循环;最后68.C延伸7min. 7.3.2 两步法反应操作步骤(如实验室没有商品化的一步法RT-PCR反应试剂采用此操作步骤7.3.2.1 RT取5LRNA，
11、加1L反转录引物(Uni12),70 .C水浴5min. 3 GB/T 27521-2011 7.3.2.2 冰浴2min，继续加入=5X反转录反应缓冲液o. 1 mol/L DTT 2. 5 mmol/L dNTPs M-MLV反转录酶RNA酶抑制剂4L 2L 2L 0.5L 0.5L DEPC水5L7.3.2.3 37.C水浴1h，合成cDNA。取出直接进行PCR或置一20.C保存。7.3.2.4 根据扩增目的片段不同，选择相应的上/下游引物进行扩增。PCR体系包括:双蒸灭菌水37.5L 反转录产物4L 上游引物O. 5L 下游引物O. 5L 10 X PCR Buffer 5L 2. 5
12、 mmol/L dNTPs 2L Taq酶0.5L首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。全部加完后，混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。7.3.2.5 PCR反应条件为:95.C预变性5min; 94 .C变性45s , 50 .C退火45s，72.C延伸45s，循环30次;72.C延伸6min. 8 扩增产物的电泳检测制备1.2%琼脂糖凝胶板，见附录A中A.1。在电泳槽中加入1XTAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝肢。取3L5L扩增产物分别和适量加样缓冲液?昆合后，加到凝肢孔。加入分子量标准。恒压(110 V)下电泳30min40 min，将电泳好的凝
13、胶放到凝肢成像系统上观察结果。9 试验成立的条件阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验元效。10 结果判定10. 1 阳性判定应用引物M-684U/M-684L、Hl-668U/Hl-668L、甲-428U/甲-428L、H3-668U/H3-668L、Nl-615U/Nl-615L、N2-246U/N2-246L，按照各基因检测体系对样品进行检测，扩增产物如果在684 bp、668bp、428坤、668bp、615bp、246bp位置出现特异性条带，则判定为猪流感病
14、毒或相应亚型病毒核酸阳性。10.2 阴性判定如果在所用引物预期扩增片段的位置均未出现特异性条带，则判定为猪流感病毒核酸阴性。4 A.1 1. 2%琼脂糖凝肢附录A(规范性附录)相关试剂的配制琼脂糖1. 2g 1XTAE电泳缓冲液加至100mL GB/T 27521-2011 放入100mL TAE电泳缓冲液(lX)中，加热融化。温度降至60oC左右时，加入5L核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm5 mmo A.2 50XTAE电泳缓冲液A. 2. 1 0.5 mol/L Z二镀四Z酸二铀(EDTA)溶液(pH8.0)二水乙二镀四乙酸二铀灭菌双蒸水氢氧化铀灭菌双蒸水A. 2. 2 TAE电泳缓冲擅(
15、50x) 瓷基甲基氨基甲皖(Tris)冰乙酸0.5 mol/L乙二镀四乙酸二铀溶液(pH8.0)灭菌双蒸水用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.3 滇化Z徒(EB)溶液A.4 DEPC水澳化乙键灭菌双蒸水18. 61 g 80 mL 调pH至8.。加至100mL 242 g 57.1 mL 100 mL 加至1000mL 20 mg 加至20mL 灭菌双蒸水100 mL 焦碳酸二乙醋(DEPC)50L 室温过夜，121oC高压灭菌15min，分装至U1. 5 mL DEPC处理过的离心管。A.5 PBS缓冲液A. 5. 1 A i液0.2 mol/L磷酸二氢铀水溶液。5 GB/T 27521-2011
16、 NaHzP04 HzO 27.6 g，溶于灭菌双蒸水中，定容至1000 mL。A.5.2 B液0.2 mol/L磷酸二氢铀水溶液。Naz HP04 7Hz 0 53.6 g(或NazHP04 12Hz 0 71. 6 g或NazHP04 2Hz 0 35. 6 g)，溶于灭菌双蒸水中，定容至1000 mLo A. 5. 3 0.01 moI/L、pH7.2磷酸盐缓冲液的配制6 0.2 mol/L A液14mL 0.2 mol/L B液36mL NaCl 8.5 g 加灭菌双蒸水定容至1000 mL。B.1 反转录引物附录B(规范性附录)引物Uni 12:5-AGCAAAAGCAGG-3。B.
17、2 PCR引物引物名称引物序列(53) 长度(bp)M-684U CAAGACCAATCCTGTCACCTC 684 M-684L AAGACGATCAAGAATCCACAA Hl-668U AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA 668 Hl-668L TGCATTCTGGTAGAGACTTTG 甲-428UCAGCAAATCCTACAGGAATG 428 甲-428LGAGATGTTCCAAGTCTGATC H3-668U TGTTACCCTTATGATGTGCC 668 H3-668L CCCTGTTGCCAATTTCAGAG Nl-615U TTGCTTGGTCRGCAAGTGC
18、615 Nl-615L YCWGTCCA YCCATTWGGATCC N2-246U CAGTAGTAATGACTGATGG 246 N2-246L CCTGAGCACACATAACTGGA GB/T 27521-2011 扩增目的片段猪流感病毒M基因猪流感病毒H1亚型HA基因猪甲型H1N1流感病毒HA基因猪流感病毒H3亚型HA基因猪流感病毒N1亚型NA基因猪流感病毒N2亚型NA基因FFON-N的hNH阁。华人民共和国家标准猪流感病毒核酸RT-PCR检测方法GB/T 27521-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销导印张O.75 字数15千字2012年1月第一次印刷开本880X12301/16 2012年1月第一版* 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-44047定价GB/T 27521-2011 打印H期:2012年2月22R F002A
