1、ICS 11. 220 B 41 道雪中华人民共和国国家标准GB/T 27539-2011 动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法Animal influenza detection-Method of real-time RT-PCR for detection of influenza virus A 2011-11-21发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。G
2、B/T 27539-2011 本标准起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、深圳匹基生物工程有限公司。本标准主要起草人:汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠。I 1 范围动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法本标准规定了A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测。2 规范性引用文件GB/T 27539-2011 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
3、。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫SN/T 1330 进出口生、熟毛皮检验规程3 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数(Ctvalue) DEPC:焦碳酸二乙醋(diethylpyrocarbonate) PBS:磷酸盐缓冲液(配方见附录A)(phosphate buffer saline) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(re
4、versetranscription polymerase chain reaction) 4 原理流感病毒(influenzavirus)属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)型。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类;甲(A)型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守。采用Taqman技术，针对M基因中特定序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针，探针的5端标记报告荧光基团(邸，3端标记萍灭荧光基团(Q)。在PCR退火阶段，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结
5、合，探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号;在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链，当链的延伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而元法继续，Taq酶发挥53外切核酸酶的功能，将探针水解成单核昔酸，标记在探针上的R基团就游离出来，R所发出的荧光不为Q所吸收而被检测仪所接收，随着PCR反应的进行，PCR产物量与荧光信号呈现正比关系。1 GB/T 27539-2011 5 材料与试剂5. 1 仪器设备5. 1. 1 荧光PCR检测仪。5.1.2 高速微型离心机(离心速度12000 r/rnin以上)。5.1.3 台式高速离心机(离心速度3000
6、 r/rnin以上)。5.2 试剂5.2. 1 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5.2.2 DEPC水(见附录白。5.2.3 Trizol。5.2.4 氯仿。5.2.5 异丙薛:-20 .C预冷。5.2.6 PBS: (1 21 :l: 2).C ,15 rnin高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000U/rnL。5.2.7 75%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20.C预冷。5.2.8 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列、反应液体系组
7、成及使用注意事项见附录B.6 抽样6. 1 采样工具下列采样工具应该经(121士2).C, 15 rnin高压灭菌并烘干:一-棉拭子;一一剪刀;一一慑子;一一注射器;一一1.5 rnL离心管;研钵。6.2 样品采集6.2.1 活动物取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下:一一取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次3次并旋转，取鼻腔分泌液;一一取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上顿裂来回刮2次3次并旋转，取咽喉分泌液;一一取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便;一一将采样后的拭子分别放入盛有1.0 rnL PBS的1.5 rnL离心管中，加盖、编号。6.2.2 脏器或肌肉组织用元菌慑
8、子采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。2 GB/T 27539-2011 6.2.3 血清、血浆用元菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。6.2.4 动物皮采样方法按照SN/T1330，将待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。6.3 样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋)，于保温箱中加冰、密封，24 h内送实验室。6.4 样晶处理6.4. 1 拭子样品在混合器上充分混合后，用灭菌慑子将拭子中的液体挤出，3000 r/min离心5min，吸取上清液1mL转入元菌的1.5 mL离心管中备用。6.4.2 脏器或肌肉组织取待检样品2
9、.0g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，4.C，取上清液1 mL转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。6.4.3 动物皮先用消毒的慑子、剪刀将动物皮剪成1mm3大小的颗粒，称取2.0g于元菌的研钵中，加液氮充分研磨后，加10mL PBS 11昆匀，4.C , 3 000 r/min离心5min，取上清液1mL转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。6.5 样品存放制备的样品在2.C8 .C条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70.C以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。7 操作方法7. 1 实验室设置标准与生物安全管理A型流感病毒通用荧光RT-PCR
10、检测按照GB/T27401 ,GB 19489 , GB/T 19495.2的规定。7.2 样晶核酸提取7.2. 1 在样品制备区进行。取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，编号。7.2.2 每管加入600LTrizol，分别加入被检样品、阴性对照、阳性对照各200L，混匀，再加入200L氯仿，上下颠倒混匀。于4.C、12000 r/min离心15min。7.2.3 取与7.2.1相同数量灭菌的1.5 mL离心管，加入等体积异丙醇(一20.C预冷)，做标记。吸取本标准7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中，吸取上清液，不能吸出中间层，颠倒混匀。3 GB/T
11、 27539-2011 7.2.4 于4.C、12000 r/min离心15min，小心倒去上清，加入600L75%乙醇(-20.C预冷)，颠倒洗涤。7.2.5 于4.C、12000 r/min离心10min，小JL倒去上清，晾干。7.2.6 加入11LDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000 r/min离心58，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存应放置一70.C冰箱。7.3 检测7.3. 1 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。荧光RT-PCR反应液体系组成见附录B，充分混匀后，转移至样品处理区。7.3.2 加样在样品处理区进行。在各设定的荧光R
12、T-PCR管中分别加入样品处理7.2.6中制备的RNA溶液各10L，盖紧管盖，500 r/min离心3080 7.3.3 荧光RT-PCR反应在检测区进行。将本标准7.3.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。循环条件设置z第一阶段，反转录42.C、30min。第二阶段，预变性92.C、3mino 第三阶段，92.C、108 , 45 c、308 , 72 oC、1min，5个循环。第四阶段，92.C、108 ,60 oC、308，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。8 结果判定8. 1 结果分析
13、条件设定直接读取检测结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8.2 质控标准8.2.1 阴性对照元Ct值并且无扩增曲线。8.2.2 阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。8.2.3 当8.2.1和8.2.2都成立时，此次试验才有效;否则，此次试验视为元效。8.3 结果描述及判定8.3. 1 阴性无Ct值并且无扩增曲线，判为阴性。4 GB/T 27539-20门8.3.2 阳性Ct值小于30，且出现典型的扩增曲线，判为阳性。8.3.3 有效原则Ct值大于30的样品建议重做。重做结果元Ct值者为阴性，否则为阳性。5 GB/T 2
14、7539-2011 附录A(规范性附录)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配方A.1 A菠(0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液)NaHzP04 Hz 027.6 g，溶于蒸锢水中，最后稀释至1000 mL。A.2 B液(0.2moI/L磷酸氢二锅水溶液)NazHP04 7HzO 53.6 g，(或NazHP04 12HzO 71. 6 g或NazHP04 2Hz 0 35.6 g)加蒸铺水溶解，最后稀释至1000 mLo A. 3 O. 0 1 mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制6 0.2 mol/L A液14mL 0.2 mol/L B液36mL NaCl 8.5 g 用蒸锢水稀释至10
15、00 mLo GB/T 27539-2011 附录B(规范性附录)引物探针序到及RT-PCR反应体系组成B. 1 引物探针序列引物探针序列见表B.L表B.l引物探针序列名称序列上游引物5-GTC TTC TAA CCG AGG TCG AAA C-3 下游引物5- AAG ATC TGT GTT CTT TCC TGC AAA -3 探针5-(FAM)-CCC TCA AAG CCG AGA TCG C- (TAMRA)-3 B.2 RT-PCR反应液体系组成10 X PCR Buffer 1. 25L 上游引物(10mol/L)o. 5L 下游引物(10mol/L)O. 5L 探针(10mo
16、l/L)0.4L MgClz (25 mmol/L) O. 75L dNTPs (25 mmol/L) O. 1L Taq酶0.25L RT-PCR反转录酶颗粒0.25颗补HzO(RNase-free)至15L B.3 说明DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。B.4 使用时的注意事项在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。RT-PCR反转录酶颗粒极易吸潮失活，应在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。=ON-mmmhNH阁。华人民共和国家标准动物流感
17、检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB/T 27539-2011 国中晤中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。0004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张o.75 字数15千字2012年1月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年1月第一版峰书号:155066. 1-44044 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27539-2011 打印H期:2012年2月22日F002A
