1、ICS 11. 220 B 41 量B中华人民共和国国家标准GB/T 27538-2011 动物流感检测A型H1Nl流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法Animal infIuenza detection-Method of pyrosequencing for HA and NA in infI uenza virus A (H 1 N 1 ) 2011-11-21发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2012-03-01实施发布目。自本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委
2、员会CSAC/TC181)归口。GB/T 27538-2011 本标准起草单位z中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林样梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。I GB/T 27538-2011 1 范围动物流感检测A型H1Nl流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型H1N1流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸序列检测方法。本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
3、凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法SN/T 1193 基因检验实验室技术要求3 缩略语下列缩略语适用于本文件。ATP:三磷酸腺昔Cadenosinetriphosphate) DNA:脱氧核糖核酸Cdeoxyribonucleic acid) DEPC:焦碳酸二乙醋Cdiethylpyrocarbonate)PBS:磷酸盐缓冲生理盐水Cpho
4、sphatebelanced solution) Pyroseqt阳lcmg:焦磷酸测序RT-PCR:反转录聚合酶链式反应Creversetranscription polymerase chain reaction) RNA:核糖核酸Cribonucleicacid) Taq酶:TaqDNA聚合酶4 原理焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺昔双磷酸酶和底物CAPS)、荧光素孵育，逐一加入四种dNTPsC dA TP , dTTP , dCTP , dGTP) ，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团
5、CPPi);ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号;光信号由电荷藕合检测器CCCD)收集并由软件转化为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核昔酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺昔双磷酸酶降解，悴灭光信号，并再生反应体系。1 G/T 27538-2011 5 试剂和材料5. 1 除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用元RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装，实验用水符合GB/T6682的规定。5.2 焦磷酸测序用引物(对)序列见附录Ao5.3 AMV反
6、转录酶。5.4 Taq DNA聚合酶。5.5 Pyro Gold SQA Reagents DNA序列分析试剂盒或其他等效试剂。5.6 DNTPso 5. 7 琼脂糖(电泳纯)。5.8 三氯甲烧。5.9 异丙醇。5.10 70%乙醇:配制方法见附录B。5.11 DNA分子量标准品(100bp 2 000 bp)。5.12 裂解液:Trizol或其他等效总RNA提取试剂。5.13 PBS:配制方法见附录B。5.14 loxPCR缓冲液:建议使用厂家提供，如需配制见附录Bo5.15 电泳缓冲液t配制方法见附录Bo5. 16 澳化乙链贮存液:用水配制成10mg/mL。5.17 电泳加样缓冲液z配制方
7、法见附录B。5. 18 磁珠悬液。6 仪器设备6. 1 焦磷酸测序仪。6.2 焦磷酸测序仪96孔板。6.3 真空吸附器。6.4 PCR仪。6.5 冷冻离心机(最大离心力12000g以上)。6.6 微量移液器。6. 7 电泳仪。6.8 紫外检测仪。6. 9 1. 5 mL Eppendorf管。7 采样和样晶制备7. 1 采样按照NY/T541和GB/T18088选取样品。样品处理和其他实验活动符合GB19489的有关规定。7.2 样品处理7.2. 1 鼻腔拭子样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌慑子将拭子中的液体挤出，3OOOg离心5min，取上清液2 GB/T 27538-2011 转入元菌
8、的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。7.2.2 肌肉或组织脏器取待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS t昆匀，4oC , 3000g离心15min，根据需要取上清液转入元菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。7.3 样本存放制备的样本在20C80C条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70oC以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。8 操作方法8. 1 病毒RNA的提取8. 1. 1 取灭菌的1.5 mL Eppendorf管，编号。8. 1.2 用微量移液器向每管中各加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对
9、照各200L，混匀后再加入200L三氯甲烧，混匀器上振荡氓匀30s。于4oC 12 OOOg离心15min. 8. 1. 3 取与8.1.1相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf管，加入一20oC预冷的500L异丙醇，做标记。吸取本标准8.1.2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L.8. 1. 4 于冷冻离心机上4oC 12 OOOg离心15min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体;加人600L70%乙醇，颠倒洗涤。8. 1.5 于4oC 12 OOOg离心10min，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体，室温干燥。8. 1. 6 加入10LDEPC水，
10、轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000g离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存须放置一70.C冰箱。8.2 RT-PCR扩增8.2. 1 反转录在3L模板中分别加入2L25 mmol/L MgC12, 1L 10 X PCR缓冲液，1L 2.5 mmol/L dNTP ，0.25L 40 U/L RNA酶抑制剂，0.5L 5 U/L AMV反转录酶，0.5L 20 pmol/f1-L焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物，用DEPC水补足体积至10L，瞬时离心混合。在PCR仪上进行反转录，条件为42.C 30 min, 98 oC 1 min
11、，冷却到4.C。8.2.2 PCR反应8.2.2.1 PCR反应体系在反转录后的10LcDNA溶液中加入10X PCR缓冲液5L，5U/f1- L Taq DNA聚合酶0.25L，20 pmol/f1-L焦磷酸测序引物对(见附录A)中的RT-PCR上下游引物各O.5L，DEPC水补足体积至50L，在PCR仪上扩增。8.2.2.2 PCR循环条件8.2.2.2.1 A型H1N1流感病毒HA基因:94 oC预变性5min , 94 .C变性30s , 60 .C退火30s , 72 oC延伸30s，共循环45次;然后720C再延伸10min. 8.2.2.2.2 A型H1N1流感病毒NA基因:94
12、 oC预变性5min, 94 oC变性30s , 56 oC退火30s , GB/T 27538-2011 72 .C延伸30s，共循环45次;然后72再延伸10min. 8.2.2.2.3 A型H1N1流感病毒墨西哥株HA基因:94.C预变性5min , 94 .C变性30s , 58 .C退火30s，72.C延伸30s，共循环45次;然后72.C再延伸10min. 8.2.2.2.4 A型H1N1流感病毒墨西哥株NA基因:94.C预变性5min, 94 .C变性30s , 55 .C退火30s，72.C延伸30s，共循环45次;然后72.C再延伸10mino 8.2.3 对照系统检测过程中
13、分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。8.3 PCR扩增产物电珠检测在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过含有澳化乙链的琼脂糖凝胶;将3L6LPCR扩增产物分别和适量电泳加样缓冲液混合，点样;以DNA分子量标准品做对照;9V/cm恒压电泳，直至澳酣蓝指示剂迁移至凝肢中部;紫外检测仪下观察电泳结果并记录;扩增到目标片段的PCR产物用于测序。8.4 焦磷酸测序8.4. 1 测序单链模板的制备8. 4. 1. 1 测序使用焦磷酸测序专用试剂盒或其他等效试剂。8.4. 1. 2 在焦磷酸测序仪96孔板中每孔预先加入44L退火缓冲破，1L20 pmol! fLL测序引物，混匀。8.4. 1. 3 混匀磁
14、珠悬液，将需要使用的磁珠总量(按每样3L)转移到一个1.5 mL Eppendorf管中，加入结合缓冲液，使得平均每样达50Lo8.4. 1. 4 将50L标记有生物素的PCR产物与50L链霉亲和素包被的磁珠混合，在室温25.C下振荡孵育20min。8.4. 1. 5 用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗30S;在70%乙晖中清洗5S;变性缓冲液洗5S;最后移到洗涤缓冲液中清洗10s。8.4. 1.6 真空吸附器放入含有焦磷酸测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放人80.C烘箱2min, 再冷却到室温。8.4.2 测序反应测序反应在28.C下于焦磷酸测序仪上进行，加样
15、使用600mb/8 ms的加样压力和时间，每轮反应时间65s。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。8.5 结果判定8.5.1 A型四川流感病毒的确定8.5. 1. 1 H1和N1RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与HLN1目标片段完全相同的，确定为A型H1Nl流感病毒亚型。8.5.1.2 H1和NlRT-PCR反应均为阳性的，H1和N1测序片段与目标片段有一个以上碱基不同定为可疑，进行HA或NA基因全序列测定，确定其亚型和毒株，如为H1N1变异株，建议将其作为新序列公布，以供其他诊断参考。8.5. 1. 3
16、Hl , Nl RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非A型H1N1流感病毒。GB/T 27538-2011 8.5.2 A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的确定8.5.2. 1 8. 5. 1中确定为A型HINl流感病毒的样品，建议采用A.2中的引物，按照8.1到8.4的程序进行测序。8.5.2.2 所得序列参照8.5.1中的方法，对照附录C中的A型HINl流感病毒墨西哥变异株的目标片段确定是否为A型HINl流感病毒墨西哥变异株。9 检测过程中防止交叉污染的措施按照SNjT1193要求执行。10 废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。5 G/T 27538-2011 附录
17、A(规范性附录)RT-PCR及测序引物A.1 A型H1N1流感病毒RT-PCR及测序引物Hl基因上游引物(88bp) 5 -TTTGGCGATCTACTCCACAGTC-3 , Hl基因下游引物5-ACCCATTAGAACACATCCAGAAGC-3 5生物素标记Hl基因测序引物5-AGAACACATCCAGAAGC-3 Nl基因上游引物(249bp) 5 -AATTGGCATGGCTCAAATCG-3 , Nl基因下游引物5- TGGATCCCAAATCATCTCAAAA-3 5生物素标记Nl基因测序引物5- CGTTTAAATACGGCAAT-3 A.2 A型H1N1流感病毒墨西哥变异株R
18、T-PCR及测序引物Hl基因上游引物(86bp) 5-GAAGACAAGCAT AACGGGAAAC-3 Hl基因下游引物5-AGGATCCAGCCAGCAATGTTAC-3 5生物素标记Hl基因测序引物5-CAAGCATAACGGGAAA-3 Nl基因上游引物(147bp) 5仁GGGAATCAAAATCAGATTGAAACA-3 Nl基因下游引物5-GGAATTGCCCGCTAATTTCA-3 5生物素标记Nl基因测序引物5-CAACTTTGCTGCTGG-3 6 B.1 70%乙醇附录B(规范性附录)试剂配制取70mL乙醇加蒸锢水稀释定容至100r。B.2 磷酸盐缓冲生理盐水配方B. 2
19、.1 A液(0.2mol/L磷酸二氢铀水溶灌)GB/T 27538-2011 一水合磷酸二氢铀(NaH2P04 H20)27. 6 g ，溶于蒸馆水中，最后稀释至1000mL。B.2.2 B液(0.2moI/L磷酸氢二铀水溶液七水合磷酸氢二铀(Na2HP04 7H20)53. 6 g , 或十二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 12H20) 71. 6 g或二水合磷酸氢二铀(Na2HP04 2H20)35. 6 gJ加蒸馄水溶解，最后稀释至1000 mL。B. 2. 3 0.01 moI/L pH7. 2磷酸盐缓冲生理盐水的配制0.2 mol/L A液0.2 mol/L B液氧化铀用蒸馆7(稀释
20、至1000 mL。B.3 10XPCR缓冲液500 mmol/L KCl 14 mL 36 mL 8.5 g 100 mmol/L Tris-Cl(pH8. 3，室温下)15 mmol/L MgC12 在1.05 kg/cm2高压下蒸汽灭菌10mino分装后贮存在20oC。B.4 电流缓冲液B. 4.1 贮存液(50x) Tris 242 g 冰乙酸57.1 mL O. 5 mol/L EDT A(pH8. 0) 100 mL 加蒸馆水至1000 mLo B.4.2 使用液将上述贮存液做50倍稀释。7 GB/T 27538-2011 B.5 漠化乙链贮存擅取1g澳化乙链加蒸馆水稀释定容至100
21、mL，磁力搅拌数小时，确保完全溶解。然后用铝锚包裹容器或将溶液保存于棕色瓶中，于室温保存。B.6 电泳加样缓冲渣8 澳酣蓝震糖加水稀释至100mL。0.25 g 40.0 g GB/T 27538-2011 附录C(规范性附录)己知亚型目标片段A型HINl流感病毒Hl目标片段:GGGGGCAATA型HINl流感病毒Nl目标片段:GGTGTTTGGATAGGA型HINl流感病毒墨西哥变异株Hl目标片段:TGCAAACTAAGAGGGGTAA型HINl流感病毒墨西哥变异株Nl目标片段:CAGTCAGTGGTT9 =ON|的mhNH因。华人民共和国家标准动物流感检测A型H1N1流感病毒中HA、NA的
22、焦磷酸测序检测方法GB/T 27538-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷开本880X 1230 1/16 印张1字数19千字2012年2月第一版2012年2月第一次印刷* 书号:155066. 1-44055定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 27538-2011 打印H期:2012年2月22H F002A
