1、ICS 11. 220 B 41 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法Isolation and identification of swine influenza virus 2011-11-21发布2012-03-01实施数码1归为中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会CSAC/TC181)归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人:乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、
2、陈化兰。GB/T 27536-2011 I GB/T 27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法1 范围本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。本标准适用于各种亚型结流感的病原分离和鉴定。2 试验材料、试剂2. 1 剪刀、慑子。2.2 1 mL注射器。2.3 单道及多道微量移液器、吸头。2. 4 91l日龄SPF鸡胚。2, 5 犬肾细胞(MDCK)。2.6 6孔培养板。2.7 DMEM培养基。2.8 HEPES缓冲液(1mol!L储存液)。2.9 胎牛血清。2.10 TPCK-膜蛋白酶(膜蛋白酶经TPCK处理)。2.11 0.01 mol!L pH7.07.4磷酸盐缓冲液(PBS)(参见附录
3、A中A.l)。2. 12 磷酸盐缓冲液(pH5.9) (参见附录A中A.5)。2. 13 0.85%生理盐水(参见附录A中A.2)。2. 14 阿氏(Alsevers)液(参见附录A中A.3)。2.15 0.5%红细胞悬液(参见附录A中A.的。2.16 胎球蛋白(参见附录A中A.6)。2. 17 过腆酸盐(参见附录A中A.7)。2. 18 亚呻酸盐(参见附录A中A.的。2. 19 硫代巴比妥酸(参见附录A中A.9)。2.20 元菌蒸锢水或去离子水。3 仪器3. 1 生物安全柜(柜内负压，有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全)。3.2 孵化器。3.3 CO2培养箱。3.4 台式
4、高速冷冻离心机。3.5 37 .C7j(浴加热器。3.6 煮沸锅。3. 7 棉拭子(医用棉签)。3. 8 研磨器。1 GB/T 27536-20门4 样晶采集与处理4. 1 样晶的采集病死猪，取肺脏或气管分泌物;待检活猪，用棉拭子(医用棉签)采集鼻腔深部分泌物。4.2 样品的保存样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液(pH7.07. 4 , 0. 01 mol!L)、0.85%生理盐水或者不含血清的细胞培养液作为保存液(含青霉素2000 IU/mL、链霉素2000 IU/ mL、制霉菌素1000 IU/mL，牛血清白蛋白5mg/mL)。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封，
5、24 h内送至实验室进行处理或置一70.C保存。4.3 样品的处理用剪刀采组织病料置于研磨器中，按质量体积比(1:1)加入样品保存液进行研磨;将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，用慑子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30min, 4 .C 3 000 r/min离心5min，取上清作为接种材料。5 样晶接种5. 1 鸡胚培辞1 mL注射器吸取处理好的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种91l日龄SPF鸡胚，每个样品接种3个胚，于35.C 37 .C孵化箱内孵育72h96 h，弃去24h内死亡鸡胚。孵化至96 h将鸡胚制冷后，元菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活
6、鸡胚的尿囊液和羊水。5.2 细胞培养在生物安全柜中操作，将60%80%长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液(不含胎牛血清，含有TPCK处理的膜酶2g/mL的DMEM培养基)洗三次，加入适量的处理样品，置于5% COz 、37.C培养箱中培养1h2 h，期间每隔30min轻轻摇动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有膜酶的培养液洗三次，加入适量的细胞维持液，5%COz ,37 .C培养箱内继续培养5d7 d，期间观察细胞病变(CPE)的形成情况。如出现CPE(特征病变为z细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落)，收集细胞培养上清。5.3 结果判定收获鸡胚
7、液或细胞培养上清，测定其血凝活性(具体操作见6.1)。若HA反应阳性说明可能有粘病毒科的病毒，应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定;若元血凝活性或血凝价很低，应盲传35代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性。6 亚型鉴定6.1 HA试验6. 1. 1 在微量反应板的112孔均加入0.05mL PBS，换吸头。6. 1. 2 吸取0.05mL待鉴定病毒液，加入第1孔，反复抽打35次混匀。GB/T 27536-2011 6. 1. 3 从第1孔吸取0.05mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.05mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.05mL弃之，换吸头。第12孔作为红细胞对照
8、。6. 1. 4 每孔均加人0.05mL O. 5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人)。6. 1. 5 轻轻混匀，室温(20.C 25 .C)下静置10min30 min后观察结果(如果环境温度太高，可置4C环境下)。对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果。6.1.6 结果判定:将反应板倾斜450，观察红细胞若没有呈泪滴状流淌，则判为HA阳性;完全血凝(不流淌)的病毒最高稀释倍数为病毒的HA效价(血凝单位用HAU表示)。反之，判为HA阴性。6.2 HI试验6.2. 1 标定参考毒株抗原及待鉴定病毒分别为4HAUC25L)。6.2.2 在微量反应板的第11l孔加入0.025mL
9、 PBS，第12孔加入0.05mL PBS。6.2.3 加0.025mL标准阳性血清至第1孔，充分混匀后吸出0.025mL于第2孔，依次对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025mL弃去。6.2. 4 111孔均分别加人0.025mL 4 HAU参考毒株抗原及待鉴定病毒，第12孔作为红细胞对照。室温(20.C25 .C)下静置10min30 min. 6.2.5 每孔均加入0.05mL O. 5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)，轻轻混匀，室温(20.C25 .C)下静置10min30 min后，观察结果(对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果)。6.2.6 结果判定:按
10、照HA试验进行结果判定。如果待鉴定病毒样品的血凝活性被这一亚型阳性血清所抑制，则该样品判为这一血凝素亚型阳性。(检测结果成立的条件:己知抗原与相应的阳性血清反应后出现预期的HI效价，同时抗原的反馈标定结果均为4HAU;反之试验重新进行。)6.3 NI试验(全量法以N1和N2分型血清为例)6.3. 1 将N1，N2标准阳性血清和阴性血清分别按原液、10倍、100倍稀释，并分别加入标记好的相应试管中。6.3.2 将已经确定HA亚型的待检病毒液稀释至HA价为16HAU，每管均加入0.05mL，混匀37.C水浴1h. 6.3.3 每管加入的胎球蛋白溶液(50mg/mL)O. 1 mL，混匀，拧上盖后3
11、7.C水浴16h18 h。6.3.4 室温冷却后，每管如入0.1mL过腆酸盐1昆匀，室温静置20min。6.3.5 每管加入1mL碑试剂(参见附录A中A.8)，振荡至棕色消失、乳白色出现。6.3.6 每管加入2.5mL硫代巴比妥酸试剂(参见附录A中A.9)，将试管置煮沸的水浴中15min，不出现粉红色的为神经氨酸酶抑制阳性，即待检病毒的神经氨酸酶亚型与加入管中的标准神经氨酸酶分型血清亚型一致。7 注意事项7. 1 标准抗原稀释液浓度为4个HAU，并且在每次试验前进行标定。7.2 孵育时间要严格控制。红细胞对照完全沉淀时要迅速判读。在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提
12、前判定或置4.C下孵育。7.3 红细胞悬液始终符合标准。7.4 反应试剂要按规定保存和使用。为避免反复冻融和细菌污染，应以无菌操作将试剂分装成小包装。7.5 冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存。7.6 操作过程生物安全注意事项见附录B.3 GB/T 27536-2011 A.1 0.01 mol/L pH7. 0-7. 4PBS NaCl KCl Na2HP04 KH2P04 灭菌双蒸水8 g 0.2 g 1. 42 g 0.27 g 800 mL 附录A(资料性附录)相关试剂的配制NaOH或者HCl调pH7.07. 4，灭菌双蒸水加至1000mL定容，121oc高压灭菌15mi
13、n或过滤除菌。A.2 0.85%生理盐水NaCl 8.5 g，加灭菌双蒸水1000 mL定容，121oc高压灭菌15min或过滤除菌。A.3 阿氏(Alsevers)液葡萄糖拧攘酸铀拧朦酸氯化铀2.05 g 0.8 g 0.055 g 0.42 g 灭菌双蒸水至100mL NaOH或者HCl调pH6.1121 oc高压灭菌15min ,2 oC8 oC保存备用。A.4 0.5%红细胞悬液采集SPF公鸡或元禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液1昆合，用PBS液洗涤3次，以3000 r/min离心5min，洗涤后用PBS配成0.5%(体积分数)红细胞悬液，20C80C保存备用。A.5
14、 PBS ,pH5.9 A溶液0.4mol/L磷酸二氢铀(NaH2P04):称取27.6g NaH2P04，溶于500mL去离子水中。B溶液0.4mol/L磷酸氢二铀(Na2HP04):称取28.4g Na2 HP04 ，溶于500mL去离子水中。取81mL溶液A，19mL溶液B71昆匀配成0.4mol/L PBS , pH5. 9。如果需要，用适当的溶液A或B调pH值。室温保存。4 GB/T 27536-2011 A.6 胎球蛋白(底物)胎球蛋白O. 5 g PBS, pH5. 9 20 mL 去离子水20 mL 分装成5mL，一200C保存。A.7 过硝酸盐溶液过腆酸铀4.28 g 去离子
15、水38 mL 加热溶解，室温冷却后加62mL 85%正磷酸混匀，置棕色瓶中，室温、避光保存。A.8 呻试剂亚呻酸铀元水硫酸铀去离子水10.0 g 7.1 g 100 mL 加热溶解，室温冷却后加0.3mL浓硫酸，室温保存。A.9 硫代巴比妥酸无水硫酸铀14.2 g 硫代巳比妥酸1. 2g 去离子水200 mL 沸水中加热溶解，室温保存。据硫代巴比妥酸的质量，一般配好10h后溶液中出现沉淀，因此该榕液要使用前配置。5 GB/T 27536-2011 附录B(规范性附录)生物安全注意事项B.1 所有的操作过程应在生物安全二级Cbiologysecurity level 2:能够安全操作，对实验室工
16、作人员和动物致病性低的，对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平)实验室中进行。B.2 亚型鉴定要求有全套的流感病毒血凝素CHA)分型血清和神经氨酸酶CNA)分型血清。6 FFON|冈山hNHS华人民共和国家标准猪流感病毒分离与鉴定方法GB/T 27536-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤印张O.75 字数13千字2012年2月第一次印刷开本880X12301/16 2012年2月第一版导书号:155066. 1-44048 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 27536-2011 打印H期:2012年2月16日F002A
