1、ICS 11.220 B 41 道B中华人民=工./、和国国家标准GB/T 27637-2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for the detectioD of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis 2011-12-30发布数码防JJ中华人民共和国国家质量监督检验检技总局中国国家标准化管理委员会2012-04-01实施发布中华人民共和国国家标准副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T 27637-2011 当酝中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城
2、区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销每开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数17千字2012年3月第一版2012年3月第一次印刷* H号:155066. 1-41345定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 27637-2011 目。吕本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位
3、:中华人民共和国广东出入境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人:刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中、吴晓薇、高小博。I GB/T 27637-2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumavium subsp.ratuberculosis)实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准造用于快速检测培养物、血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，
4、其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBjT 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489-2008实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值:荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数。dNTP: deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核昔三磷酸。DMSO: dimethyl sulfoxide，二甲基亚酬。EDT A: ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胶四乙酸。PBS: phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液。PCR: polymerase chai
5、n reaction，聚合酶链式反应。Taq酶:TaqDNA聚合酶。UDG酶:uracil DNA glycosylase，尿唔睫DNA糖基化酶。4 原理本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的引物，和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5端标记了被称为报告基团的荧光素，3端标记了摔灭基团。在进行PCR延伸反应时，Taq酶的5外切酶活性将V端荧光基团从探针上切割下来，使其与洋灭基团分离，从而仪器能检测到5端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加，仪器检测到的荧光信号的累积
6、反应了扩增产物量的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板，设计特异扩增引物和探针建立荧光PCR反应体系。5 材料与试剂5. 1 仪器与耗材5. 1. 1 接种棒。1 GB/T 27637-2011 5. 1.2 元菌注射器或真空采血管。5.1.3 灭菌容器。5.1.4 橡胶管。5.1.5 刮匙。5.1.6 荧光PCR仪。5. 1. 7 恒温水浴锅(室温至100.C)。5. 1. 8 离心机(最高离心力达15000Xg以上)。5. 1. 9 混匀器。5. 1. 10 冰箱(2.C8 .C，一20.C, -80 .C)。5. 1. 11 天平(精密度达千分之一以上。5. 1.
7、12 微量可调移液器(10L.100L，1000L)。5. 1. 13 微量带滤芯吸嘴(10L，100L，1000L)。5. 1. 14 研钵。5. 1. 15 离心管。5.1.16 PCR光学反应管。5.2 试剂5.2. 1 试剂级别:除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682-2008规定的二银水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2 引物与探针:采用元DNA酶、元RNA酶水将每条引物与探针配制成100mol/L储存液，置一20.C或更低温度冻存;使用时取适量配制成10mol/L工作液，避免多次冻融。上游引物:5GTCAGCGGCGGTCCAG 3 ，下游引物:5 GCAGCTCCAG
8、A TCGTCA TTC 3 I探针:5 -FAM ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC 3-BHQ-1. 5.2.3 0.01 mol/L pH7. 6 PBS:配方见A.10 5.2.4 拧棱酸铀缓冲掖:配方见八.20 5.2.5 0.5 mol/L EDTA:配方见A.3。5.2.6 拧棱酸铀磷酸缓冲液z配方见A.4。5.2.7 4%氢氧化铀溶液:配方见A.5。5.2.8 4%硫酸溶液:配方见A.6。5.2.9 TritonX-100o 5.2.10 DNA提取液:含100mmol/L Trs-HCl (pH8. 0).0. 01% Triton X-100，200g/L蛋白
9、酶K。也可采用等效商品化试剂。5.2. 11 灭菌双蒸水。5.2. 12 三氯甲烧。5.2. 13 异丙醇。5.2. 14 元水乙醇。5.2. 15 70%乙酶:用新开启的灭菌双蒸水配制，一20.C预冷。5.2. 16 荧光PCR反应缓冲液:含50mmol/L KCl , 10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 3) , 2.5 mmol/L MgC12，5%二甲基亚飘(DMSO)，5%甘油。可采用等效商品化试剂。5.2.17 dNTP: dATP、dUTP、dCTP和dGTP.5.2. 18 Taq酶。5.2.19 UDG酶。 GB/T 27637-2011 6 生物安全要求采样、
10、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守GB19489-2008的有关规定。7 采样7. 1 样晶采集7. 1. 1 培养物直接取液体培养基培养的菌液;对于在团体培养基上生长的菌藩，用接种棒挑取适量(取用量达到肉眼可见，菌团大小不超过接种环菌样，放到0.01mol/L pH7. 6 PBS中，振荡混匀形成悬浮菌液。7. 1. 2 血样用无菌注射器或真空采血管，元菌自动物静脉采血，元菌分离血清。用无菌注射器或真空采血管，无菌自动物静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用拧攘酸铀缓冲液，或O.5 mol/L EDT A。每6mL血液加1mL抗凝剂。条件允许时，建议优
11、先采集全血，以更有利于富集菌体。7. 1. 3 奶样元菌采集奶液于灭菌的容器中。一般以后段奶液含菌量较多，早晨挤出的奶液含菌量较高。7.1.4 粪便取新鲜粪便，选取腹泻粪便或混有粘液、血液、粘膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。7. 1. 5 组织选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结。7.2 样品的保存和运输待检样品在2oC8 oC保存不应超过24h;一200C保存不超过三个月;一800C以下长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。8 操作方法8. 1 样品前处理8. 1. 1 血样、培养物(菌液)前处理取1mL2 mL全血样品，1
12、5000 X g离心10min，弃上清;加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15000Xg离心10min;弃上清，若红血球裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一200C贮存备用。取1mL2 mL血清、菌液样品，15000Xg离心10min，弃上清，加1mL O. 01 mol/L pH7. 6 PBS, 充分振荡混匀，15000Xg离心10min;弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置-20oC备用。3 GB/T 27637-2011 8. 1. 2 奶样前处理取10mL奶液，加100LTriton X-100，振荡混匀，2500Xg离心20min;弃上清，取沉
13、淀，加1mL 0.01 mol/L pH7. 6 PBS，充分振荡混匀，将沉淀悬浮液移入微量离心管，15000Xg离心10min;弃上清，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20C贮存备用。8. 1.3 粪样前处理取粪样1g2 g，按1: 5的比例加入4%硫酸溶液(例如1g粪样，加5mL液体)充分振荡混匀，室温静置0.5hlh;取上层约3mL液体(避免吸取粗渣)，5000Xg离心1min，取上清，15000Xg离心10 min;弃上清，加等量0.01mol/L pH7. 6 PBS，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000Xg离心10min;弃上清，重复本步骤1次;收集沉淀物，继续进行核酸提取，或
14、置一20C贮存备用。8. 1. 4 组织样晶前处理取适量组织样品(剔除脂肪、被膜)，剪碎，按1: 5的比例加入拧朦酸铀-磷酸缓冲液(例如，1g组织样品，加入5mL缓冲液)，充分研磨;加等量4%氢氧化铀溶液，继续研磨5min10 min，使组织液化;充分振荡，75c温浴0.5hlh;取上清(避免吸取粗渣)，15000 X g离心10min;弃上清，加等量0.01 mol/L pH7. 6 PBS，振荡混匀，使沉淀充分悬浮，15000Xg离心10min，弃上清，重复本步骤1次;收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置一20c贮存备用。8.2 核酸提取在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加入50L100L
15、DNA提取液，充分振荡混匀，56c温浴30min, 98 C 100 C加热10min，瞬时离心使液滴聚集管底，加等体积三氯甲皖，振荡混匀，12000Xg离心5min，取上清，直接用于PCR或贮存于一80C备用(适用于除粪样外的其他样品)。粪样样品还需进行以下步骤:加入等体积异丙醇(-20 c预冷)，颠倒混匀，放置5min 10 min; 4 c、15000Xg离心10min，弃上清，加3倍体积70%乙醇(4C预冷)，振荡洗涤;4 C , 15 000 X g离心10 min，弃上清，室温干燥5min;加入50L元DNA酶、元RNA酶水，混匀、溶解核酸，直接用于PCR或贮存于一80C备用。可采
16、用经验证的商品化核酸提取试剂盒。8.3 扩增反应8.3. 1 对照设立从样品处理开始，应设置阳性对照、阴性对照。阳性对照:取已知阳性的同类样品作为阳性对照，也可将适量灭活的病原菌添加到已知阴性样品中作为阳性对照样品。阴性对照:取已知阴性的同类样品作为阴性对照。空白对照:在扩增反应阶段设置。以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照。8.3.2 扩增试剂准备采用25L反应体系，含以下成分:10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 3) , 50 mmol/L KCl , 2.5 mmol/L MgC12 ,0. 2 mmol/L dNTP，上、下游引物各0.2mol/L，探针O.1mol/L，5%
17、 DMSO，5%甘油，0.4U UDG酶，1UTaq酶，5L核酸模板。取出荧光PCR反应缓冲液等试剂，室温融化(Taq酶、UDG酶除外)，瞬时离心后置冰上，根据上述4 GB/T 27637一20门反应体系、按每个反应20L的用量配制荧光PCR预混反应液，不足部分加灭菌双蒸水补足;需配制的荧光PCR预混反应液数量=样品个数十对照个数+1。将各试剂按使用量吸取到微量离心管中，充分混匀，然后在每个PCR光学管中分装20L。8.3.3 加样在已分装有荧光PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加人5L样品或对照的核酸模板，混匀，盖上管盖，放人荧光PCR仪，记录样品放置顺序。8.3.4 荧光PCR扩增检
18、测反应条件设定:第一阶段:50.C2 min ,95.C 4 min，l个循环;第二阶段:95.C10 s , 60.C 45 s，40个循环，60.C时设置采集荧光。荧光素设定z报告荧光Creport dye)设定为FAMC或按探针实际标记的荧光基团设定)，萍灭荧光Cquench dye)设定为None，校准荧光Creferencedye)设定为None.可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。9 分析条件设定和结果判定9. 1 阐值设定综合分析仪器给出的各项结果，基线Cbaseline)以仪器给出的默认值作为参考，阔值Cthreshold)设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高
19、点为准，具体还需根据仪器噪声情况进行调整，选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析。9.2 质控阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照的Ct值应30，且呈现S型典型扩增曲线。否则，此次实验视为元效。9.3 结果分析及判定在质控有效的条件下进行结果判定。阴性反应结果判定:检测结果呈现无Ct值、元扩增曲线或反应曲线元明显对数增长期，判为荧光PCR阴性反应，样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阴性。阳性反应结果判定:检测结果呈现Ct值35、且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光PCR阳性反应，样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阳性。对于35Ct值40的样品，需重新取样进行重复检测。如果重复检测的Ct值40，
20、且曲线有明显的对数增长期，判为阳性反应。否则判为荧光PCR阴性反应。必要时，对初次检测呈荧光PCR阳性反应的样品进行重复检测。10 注意事项检测过程防止交叉污染应注意的事项见附录B。5 GB/T 27637-2011 A.1 0.01 mol/L pH7. 6 PBS 先配制A液、B液。附录A(规范性附录)试剂的配制A液(0.2mol/L NaHzPO.溶液):称取一水合磷酸二氢铀(NaHzP04 HzO)27. 6 g，或二水合磷酸二氢铀(NaHzP04 2HzO)31. 2 g，溶于蒸馆水中，定容至1Lo B液(0.2mol/L Naz HPO.溶液):称取十二水合磷酸氢二铀(NazHP0
21、4 12比0)71.6 g，或二水合磷酸氢二铀(NazHP04 2HzO)35. 6 g，溶于蒸锢水中，定容至1L。称取17g氯化锅，用适量蒸馆水溶解，量取13mLA液和87mL B液，混合，用蒸馆水定容至2L。采用(121士2)OC/0.1MPa ,15 min高压灭菌后贮存于40C。A.2 拧穰酸铀缓冲液拧朦酸(C6H807 HzO) 5.3 g 拧棱酸铀(Na3C6HS07 HzO) 15 g 葡萄糖(C6H1206 HzO) 16.2 g 称取上述试剂，溶解于蒸馆水，定容至1L，混匀。采用1210C土2oC/O. 1 MPa, 15 min高压灭菌后贮存于40C。A.3 0.5 mOl
22、/L EDTA(pH8. 0) 称取186.1g EDTA，加入800mL蒸馆水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化铀(NaOH)调pH至8.0，定容至1L，分装，采用(121士2)OC/0.1 MPa,15 min高压灭菌后贮存于室温。A.4 拧穰酸铀-磷酸缓冲液先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(0.2mol/L磷酸二氢铀溶液):称取磷酸二氢铀(NaHzPO. 2HzO)15. 61 g，加双蒸水溶解，定容至500mLo B液(0.2mol/L磷酸氢二铀溶液):称取磷酸氢二铀(NazHP04 12HzO)35. 82 g，加双蒸水溶解，定容至500mL。分别量取51mL A液、49mL B液，
23、混合即成100mL pH6. 8磷酸缓冲液。称取2.84g拧棱酸铀(Na3C6HsO.2HzO)，加入100mL pH6. 8磷酸缓冲液中，充分榕解。采用(121士2)OC/0.1MPa, 15 min高压灭菌后贮存于40C。A.5 4%氢氧化铀溶渡称取8g氢氧化铀，加入200mL双蒸水中，充分溶解。室温贮存。6 GB/T 27637-2011 A.6 4%碗酸溶渣量取20mL浓硫酸，加入500mL双蒸水中，混匀。室温贮存。FFON|hghNH阁。GB/T 27637-2011 附录B(规范性附录)检测过程防止交叉污染的措施B.1 采样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污
24、染。采样及样品处理工具应经过高压灭菌或高温烘烤处理，一套工具仅限一个样品使用。存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高温烘烤处理，或使用一次性灭菌容器。B.2 实验过程，应穿工作服和戴一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。B.3 使用带滤芯吸嘴。吸嘴、离心管、PCR管等应一次性使用，不得回收清洗后重复使用。B.4 样品处理与PCR加样应在不同的区域进行，不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可密闭进行紫外消毒的超净工作台、生物安全柜等。若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样，该空间应安装紫外灯或配备具有等同降解核
25、酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该容器应能耐受煮沸、10%次氯酸铀溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。B.5 PCR反应试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多次开启使用。B.6 装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管崩开，所有操作尽量避免产生气溶胶。B.7 上机运行前，应检查并盖紧各PCR管，以防荧光物质或模板泄漏而污染机器。B.8 应遵循基因检测实验室其他技术要求。版权专有侵权必究导书号:155066 1-44345 定价:16.00元GB/T 27637-2011 打印忖期:2012年4月1Fl F002A
