1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民-=H工./、道雪和国国家标准GB/T 28067-20门甘震黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法Detection of sugarcane yellow leaf virus using the real-time RT-PCR 2011-12-30发布数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布GB/T 28067-2011 目。吕本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:福建农林大学甘蔚综合研
2、究所、农业部甘肃及制品质量监督检验测试中心、农业部甘煎遗传改良重点开放实验室。本标准主要起草人z高三基、陈平华、陈如凯、郭晋隆、张华、许莉萍、王恒波、陈由强。I GB/T 28067-2011 甘康黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法1 范围本标准规定了甘煎黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法所需的仪器与试剂、样品的采集与前处理、操作方法以及结果判定。本标准适用于甘煎植株、种苗及种茎中甘煎黄叶病毒的快速检测、诊断。2 术语和定义2.1 2.2 2.3 下列术语和定义适用于本文件。反转录reverse transcription 以RNA为模板合成DNA的过程，也称逆转录。实时荧光RT-PCRr
3、eal time RT-PCR 实时荧光反转录-聚合酶链式反应。Ct值cycletime 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。3 缩略语下列缩略语适用于本文件。RNA:核糖核酸Taq酶:TaqDNA聚合酶dNTPs:4种脱氧核昔5-三磷酸混合液RNase:RNA酶M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurine leukemin virus)反转录酶FAM:6-援基荧光素TAMRA:6-援基四甲基罗丹明4 方法原理在反转录酶作用下将RNA反转录成cDNA，再cDNA为模板利用Taq酶进行实时荧光PCR扩增反应(采用TaqMan探针方法)。在比对甘煎黄叶病毒外壳蛋白基
4、因的基础上，设计一对仅在甘庶黄叶病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5端标记FAM荧光素为报告荧光基团，3端标记TAMRA荧光素为摔灭荧光基团，结合部位位于目的扩增片段内部。当完整的探针与目的序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3端的摔灭剂接近而被摔灭，仪器检测不到荧光信号;但在进行延伸反应时，Taq酶发挥5Y的外切核酸酶功能，将探针降解，使得荧光基团GB/T 28067-2011 与洋灭剂分离，所发出的荧光不再为摔灭剂所吸收而被检测仪所接受。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。5 甘蔚黄叶病毒基本信息5.1
5、 病毒粒体形态特征甘肃黄叶病毒粒体为二十面对称体，直径24nm29 nm，浮力密度1.30 g/c时，由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义的RNACssRNA)构成，病毒基因组大小约6kb。5.2 寄主范围自然寄主为甘庶属中的热带种CSaccharumoj声cnarum)、大茎野生种CSaccharumrobus归tm)、中国种CSaccharumsinensis)和割手密CSaecharumsontaneum)。实验寄主包括蔚茅属(Erianthussp. )、小麦、燕麦、大麦、水稻、玉米和高粱等。在寄主植株内的分布主要局限于组织韧皮部内。5.3 寄主症状田间病症表现为甘庶叶片中脉黄化，并
6、向两侧扩展，中脉下表皮为鲜黄色，上表皮仍是正常的白色或绿白色，有的染病品种叶片中脉两侧出现红褐色。染病植株叶片从叶尖开始干枯坏死，并向下扩展，严重感病植株叶片发黄、坏死。由甘庶黄叶病毒引起的这种病害称为甘煎黄叶病(Sugarcaneyellow leaf disease) ，早期称为甘蔚黄叶综合症Csugarcaneyellow leaf syndrome)。5.4 分布地区甘蔚黄叶病1989年首次发生在美国夏威夷，随后陆续在美国的弗罗里达州、德克萨斯州、路易斯安那州以及巴西、澳大利亚、南非、中国、印度等30多个国家和地区出现并不断蔓延扩大。5.5 传播途径由甘庶甥虫CMelarniphis
7、sacchari)、甘w;绵蜻CCeratovacuna laniger，)、玉米叶甥CRhopalosihummaidis)和水稻根际甥虫(Rholosi户humru卢abdominalis)传播，也可由感病的种茎传播，但不能通过种子、机械摩擦方式传播。6 病毒的分类信息国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告将甘庶黄叶病毒列入黄症病毒科CLuteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中成员，英文名称为sugarcaneyellow leaf virus，缩写为SCYLV。7 仪器与设备7. 1 实时荧光PCR检测系统。7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3 电
8、子天平:感量0.01g。7.4 高速台式冷冻离心机:离心力12000 g以上。GB/T 28067-20门7.5 微量加样器:0.1L2. 5L，0.5L10L，5L20L，10L100L，10L200L， 100Ll 000L。7.6 元RNA酶的离心管、PCR反应管、Tip头、实时荧光PCR反应管。7.7 恒温水浴锅。7.8 鼓风干燥箱。7.9 冰箱:2.C4 .C，一20.C，一80.C。8 试剂与材料8. 1 试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂;所有试剂均用元RNA酶的容器分装。8. 1. 1 三氯甲:院。8.1.2 异丙醇。8.1.3 75%乙醇飞8. 1. 4 元RNa
9、se水及双蒸水。8. 1. 5 裂解液:主要成分为异硫氨酸肌和苯酣，为RNA提取试剂。8. 1. 6 5 X反转录反应混合液:含5X反转录反应缓冲液、dNTPs、RNase抑制剂、M-MLV反转录酶，具体配制方法参见附录A。8. 1. 7 检测引物5人引物:5人TTCAGTA T AACTCA TGCTCCTCCG-3 3人引物:5人ACTTTCTTGGCGTTCCTCTTG-3 扩增片段大小为130bp。8. 1. 8 TaqMan探针:5 -F AM-CGCAACTCCAGGTGCAA TCGC-T AMRA-3。8. 1. 9 含有EXTaq荧光PCR反应混合液含有2XEXTaq荧光PC
10、R反应液、5人引物、3人引物、TaqMan探针，具体配制方法参见附录A。8.2 材料8.2.1 阳性对照:用已知含甘庶黄叶病毒的样品作阳性对照。8.2.2 阴性对照:用已知不含甘煎黄叶病毒的样品作阴性对照。9 样品的采集与前处理9. 1 取样工具砍刀、剪刀、慑子等取样工具应经121.C士2.C、1.1 X 105 Pa高压灭菌15min或经160.C干炜2 h。9.2 采样方法9.2. 1 采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。9.2.2 叶片样品:取甘lf，植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(-1叶)叶片，编号备用。1) 用无RNase水配制。3 GB/T 280
11、67-2011 9.2.3 蔚茎样品:取甘震植株可见肥厚带叶下两叶(+3叶)对应的煎茎，若为甘庶煎种，取中部种茎，编号备用。9.3 存放与运送采集或处理的样本在2.C8 .C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，要求放置一80.C冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，或用液氮处理，尽快运送到实验室。10 操作方法10. 1 总RNA的提取10. 1. 1 取1.5 mL元RNA酶的离心管，并对每个管进行编号。10. 1. 2 称取0.2g样品材料(庶茎样品要去除表皮)，并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干净。10. 1. 3 向1.5 mL离心管中加入粉末
12、，等液氮刚挥发完立即加入1mL裂解液，盖上管盖，振荡混匀，于4.C、12000 g离心10min。10. 1. 4 吸取上清液至另一新的离心管中，加入0.2mL三氯甲:院，盖住管盖，剧烈振荡混匀约15s，室温静置3min后，于4.C、12000 g离心15min。10. 1. 5 吸取上清液至另一新的离心管中，加入0.5mL预冷的异丙醇(-20 .C)，颠倒混匀，室温静置10 min后，于4.C、12000 g离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。10. 1. 6 小心倒出离心管中上清液，加人1mL 75%预冷的乙醇(-20.C)洗涤，颠倒离心管2次3次，7500 g离心5mi
13、n(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。重复洗涤沉淀1次。10. 1. 7 小心倒出离心管中上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀的一面，室温干燥10min15 min。10. 1. 8 加人50L元RNase水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000 g离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增;若需长期保存，应放置一80.C冰箱。10. 1.9 取5LRNA溶液加元RNase7135.0的样本应重做。重做结果元Ct值者为阴性，否则为阳性。11. 4 结果表述该试样中检出甘蔚黄叶病毒。该试样中未检出甘庶黄叶病毒。5 G/T 28067
14、-20门附录A(资料性附录甘黯黄叶病毒反转录反应与实时荧光PCR扩增反应混合液配制表A.l每个测试样本反转录反应混合液配制的组分及使用量试剂使用量25L反应体系终浓度5X反转录反应缓冲液(Mg2+P!us) 5.0L lX 10 mmol/L dNTPs 1.0L 0.4 mmol/L 10 U/L RNase抑制剂0.5L 5 U/25L 200 U/L M-MLV反转录酶1.0L 200 U/25L 无RNase水7.5L 总体积15.0L 表A.2每个测试样本荧光PCR扩增反应混合液配制的组分及使用量试jfIJ 使用量25L反应体系终浓度2X荧光PCR反应液(含Taq酶)12.5L lX
15、 5引物(10mol/L)1.0L 0.4mol/L 3人引物(10mol/L)1.0L 0.4mol/L 荧光探针(10mol/L)1.0L 0.4mol/Ul 双蒸水8.5L 总体积24.0L 2) 探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。6 FFONlhgNH阁。华人民共和国家标准甘震黄叶病毒实时荧光RT-P检测方法GB/T 28067-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数13千字2012年4月第一次印刷开本880X12301/16 2012年4月第一版峰16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号;155066. 1-44581 GB/T 28067-2011 打印H期:2012年4月23H F002A
