1、ICS 65.020.01 B 16 中华人民=IJ工./、GB 和国国家标准GB/T 28068-2011 柑桔溃殇病菌实时荧光PCR检测方法Detection of Xanthomonas citri subsp. citri using the real-time fluorescent PCR 2011-12-30发布2012-06-01实施、，饲/伪中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会发布G/T 28068一2011目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:
2、重庆大学、农业部农业技术推广服务中心、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:王中康、殷幼平、王福样、高文娜、夏玉先、李正国、曹月青。I GB/T 28068-20门柑桔溃窃病菌实时荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了柑桔溃癌病菌CXanthomonascitri subsp. citri , Xcc)的实时荧光PCR检测的样品制备、检测技术、操作方法及结果判定标准。本标准适用于柑桔植物材料中柑桔溃痛病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包
3、括所有的修改单)适用于本文件。GB 5040 柑桔苗木产地检疫规程GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 柑桔溃踊病citrus canker disease 由柑桔渍癌病菌引起的国内外柑桔检疫性细菌病害。症状特征表现为柑桔叶片、枝条和果实表面出现隆起的木栓化溃癌病斑，造成柑桔落叶落果、树势衰弱，严重影响柑桔产量与果品外观质量。3.2 柑桔溃痛病菌Xanthomonas citri subsp. citri 指引起亚洲型柑桔溃痛病的病原细菌，为黄单胞菌属的柑桔黄单胞柑桔亚种新组合CSchaad 2006; Young 2008)
4、。3.3 实时荧光PCRreal-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物质的释放并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。3.4 扩增引物primer 人工合成的寡核昔酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。3.5 扩增模板templet DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。3.6 Ct值cyclethreshold value 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数。l GB/T 28068-20门3. 7 柑桔溃癌病菌
5、重组质位利用特异性引物扩增柑桔溃癌病菌(Xanthomonascitri subsp. citri)基因组模板，获得的柑桔溃癌菌特异性DNA扩增序列构建重组质粒，将该重组质粒转导到大肠杆菌JM109菌株中繁殖培养后，重新提取出获得的质粒DNA。用于作为柑桔溃痛病菌检测的阳性对照。4 柑桔渍痛病菌基本信息拉丁学名:柑桔黄单胞菌柑桔亚种Xanthomonascitri subsp. citri Gabriel et. al (1989)。病害名称:柑桔溃癌病citruscancer disease 0 分类地位:假单胞菌科Pseudomonaceae、黄单胞菌属Xanthomonas，柑桔黄单胞X
6、anthomonascitri Gabriel et.al (1989)J。主要分布于亚洲的中国，印度和东南亚，美洲的美国、巴西、乌拉圭、巴拉圭和阿根廷等国家和地区。葡萄袖、甜橙、拧棒、莱棱、柑桔和积等柑桔种和品种。带菌种苗、接穗及商品果实是远距离传播的主要途径;田间则主要由夹风雨和农事操作传播。柑桔溃癌病菌其他信息参见附录Ao利用柑桔溃癌病菌亚种通用引物对XccFOS/XccR05，以常规PCR方法可以检测出柑桔材料中柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)和褐色黄单胞莱撮亚种(BC/D菌系)(检测引物、检测方法及结果判定参见附录B)。5 方法原理本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针
7、法两种检测方法其原理是，利用病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结合而发出荧光被检测器实时检测(荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双标记探针，探针V端和3端分别标记荧光素报告基团和摔灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，Taq DNA聚合酶将探针水解成单核昔酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测(荧光探针法)。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阔值时所经历的Ct值不同，因此Ct值可
8、以用于判定检测样品的初始菌量。6 实验室设置柑桔溃癌病菌PCR检测实验室主要参照GB/T19495.2设置与管理。检测实验室应至少分为三个相对独立的工作区域:样本制备区、反应试剂配制区和检测区;每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。7 材料与试剂7. 1 仪器与器材7. 1. 1 实时荧光PCR仪。7. 1. 2 高速台式离心机。7. 1.3 生物安全柜或超净工作台。7. 1. 4 冰箱(冷藏室4.C和冷冻室一20.C)。7. 1. 5 涡旋混匀仪。7. 1. 6 紫外灭菌灯。7. 1.7 微量可调移液器(0.5L10L、10L100L、100L1000L)。7. 1.
9、 8 带滤芯Tip头。7.1.9 PCR反应管(0.2mL八联管)。7. 1. 10 微滤柱。7. 1. 11 高压灭菌锅。7.2 试剂7.2.1 磷酸二氢铀(NaH2P04 H20)。7.2.2 磷酸氢二铀(Na2HP04.7H20)。7.2.3 三连甲基氨基甲皖(Tris)。7.2.4 乙二肢四乙酸(EDTA)。7.2.5 实时荧光PCR混合试剂(Real-timePCR Master Mix)。8 采样及样品处理8. 1 采样及样品处理工具8.1.1 样品袋:牛皮纸袋或信封(一次性使用)。8.1.2 枝剪。8. 1.3 剪刀，慑子。8. 1.4 塑料离心管(1.5 mL , 50 mL)
10、。G/T 28068-2011 8. 1. 28. 1. 4的取(制)样工具应经121.C士2.C , 15 min高压蒸汽灭菌。田间取样每个样品采集后或实验室处理每个不同样品后，工具应用70%酒精棉球擦拭2次以上，以避免样品间相互污染。8.2 取样方法8.2.1 田间采集田间实地取样参照GB5040。取带有柑桔疑似溃癌病病斑的柑桔叶片、嫩梢和果实样品(柑桔溃癌病症状特征参见附录A)。8.2.2 口岸检瘟及调运检瘟抽样种苗抽取显现疑似症状植株或随机抽取植株(元症材料)10株，每株取叶片5片，共50月;接梅等材料则随机直接抽取10份材料;商品果采集带有疑似病斑的果实。样品采集后立即装人样品袋。按
11、规定编号密封后，做好相关记载，包括样品品种、目测症状、采样人、采集地、采集时间等。及时寄送检测实验室。8.3 样晶存放采集的植物材料若需短暂保存，应置于4.C条件下，可保存1周。检测后余下的植物材料应置于4 .C条件下保存7d，以备复测的需要。8.4 样晶DNA制备操作样品DNA制备在检测实验室样品制备区进行。所制备的DNA样本在4.C条件下保存应不超过3 GB/T 28068-2011 7 d，在一200C冻存不超过30d，避免反复冻融。样品制备的具体操作过程见附录C。9 PCR检测操作9.1 所用引物对与探针荧光染料法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF 02/CQUXcc R 02，
12、序列为CQUXccF 02: 5 -ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3 , , CQUXcc R 02:5-TCTG ACCACATCGCAT AGGA-3。荧光探针法PCR检测所用特异性引物对CQUXccF 06/CQUXcc R 06，序列为CQUXccF 06: 5人GCGGCTATTGGCTGACTTCA-3和CQUXccR 06: 5人GTAGGGCGGACCTT GGGAT-3气荧光标记探针CQUXccPl，序列为5-TCCTCCA T AACGAACTCGCAAGGCACG-3。9.2 扩增准备PCR扩增反应体系为25L。准备PCR扩增反应管，分别加入反应液23L，最后
13、加入制备的待测样品2L。每个样品设置3次重复。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。9.3 扩增过程扩增过程中，设置每次循环的延伸阶段采集荧光。荧光染料法检测应在扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线的反应程序为:97oC , l min;57 oC , l min;从57oC开始每升高O.5 oC保持10s，连续升高80次(到97oC 为止)。检测结束后，根据采集的荧光曲线和Ct值判定结果。实时荧光PCR扩增的准备及扩增具体操作过程见附录(不同PCR仪具体程序参数可能稍有调整)。推荐使用柑桔溃病病菌实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒组成、功能及使用注意事
14、项参见附录E。10 结果判定及描述10. 1 结果分析条件设定直接读取检测结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况自动调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。10.2 质控标准10.2. 1 阴性对照及空白对照元Ct值并且无扩增曲线。否则，此次检验视为元效。10.2.2 阳性对照的Ct值应28.0，并出现典型的上升扩增曲线。否则，此次检验视为无效。10.3 阴性测试样品检测无Ct值和扩增曲线，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品为阴性，表示样品中无柑桔溃癌病菌。10.4 阳性测试样品检测Ct值35，出现典型的扩增曲线，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定4 该样
15、品为阳性，表示样品中存在柑桔溃痛病菌。10.5 其他情况GB/T 28068一20门Ct值大于36的样品，建议重做实时荧光PCR扩增，扩增结果按上述标准判定。扩增结果Ct值若仍大于36，结果判定为阴性。5 GB/T 28068-2011 附录A(资料性附录)柑桔渍痛病症状及病原茵的名称及鉴别特征比较A.1 分类命名A. 1. 1 概要柑桔溃癌病是由柑桔黄单胞细菌引起的柑桔重要检疫性病害;主要随带菌苗木或接穗远距离传播，随夹风雨溅射在田间扩散。近年来，柑桔溃痛病菌的分类地位和命名变动较大，原来的柑桔溃痛病菌的A，B/C/D和E菌系，依据16SrRNA基因、多基因分类新方法和培养特征等综合分类方法
16、已经归入三个不同的细菌种下的三个亚种:柑桔黄单胞柑桔亚种(A菌系)、褐色黄单胞莱棱亚种(BC/D菌系)和首宿黄单胞积袖亚种(E菌系)。A. 1.2 柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnascitri subsp. citri) 原称为A系的柑桔黄单胞柑桔亚种(Xanthomnascitri subsp. citri) ，是依据N.W. Schaad (2006) 和J.M. Young (2008)的黄单胞属最新分类命名的调整确认，是分布最广、危害最重的一种柑桔溃癌病的检疫性细菌，可以侵染芸香科柑桔属、积属的大部分柑桔种类。病菌在血清学、DNA-DNA复性测定、ITS测序、rep-PCR和培养
17、特征等方面都不同于其他黄单胞属的细菌。A. 1.3 褐色黄单胞莱攘亚种(X.fuscans subsp. aurantifolii) 根据DNA-DNA复性测定和多基因测序的相似率，把仅引起南美的墨西哥菜棱、拧棱、酸橙和袖子溃弱病的原B/C/D菌系归入褐色黄单胞莱棱亚种(Xanthomonasfuscans subsp. aurantifolii)。A. 1.4 茵蓓黄单胞积抽亚种(X.alfalfae subsp. citrumelonis) 原柑桔溃癌病菌E菌系，引起美国佛州柑桔苗圃的柑桔斑点病。现依据病害症状、同工酶谱带等不同于柑桔亚种的特征，归入到盲宿黄单胞积袖亚种(X.alfalfa
18、e subsp. citrumelonis)。A.2 柑桔渍痛病症状A. 2.1 主要症状柑桔溃癌病菌可以侵染柑桔叶片、枝条和果实等地上部分。主要症状特征为产生两面木栓化病斑，中心突起呈火山口状。A.2.2 叶片症状叶片初始病斑呈圆形、微突起、半透明服泡状;病斑两面隆起、圆形或近圆形，周围大多有黄色晕圈和轴圈;老病斑木栓化，表面粗糙开裂呈火山口状，晕圈不明显;病斑单生，严重时愈合成片。在潜叶峨危害的伤口处往往成片发生图A.1a) 。与柑桔疮躏病等叶部类似症状的区别在于受害叶片仅一面出现隆起的近圆锥形病斑，另一面凹陷。病斑较多时，叶片扭曲畸形，病斑周围仅有黄色晕圈而无轴圈。 GB/T 28068
19、-2011 a) 柑桔溃荡病叶片初期病斑b) 柑桔溃殇病枝条后期病斑c) 柑桔溃痛病果实典型病斑图A.1柑桔溃痛病寄主植株典型症状A.2.3 枝条症状在嫩枝上，产生坏死扁平的病斑，有时具有油浸状的边缘，没有黄色晕圈图A.1 b) 。A. 2. 4 果实症状在幼果的病斑有黄色晕圈，果实上的火山口开裂更加明显，严重时愈合成片。疮癫病罹病果实病斑呈散生或群生的瘤状突起，可以剥落图A.lc)J。A.3 鉴别特征比较柑桔溃菇病菌及其类似病原菌的鉴别特征比较见表A.l。表A.1柑桔遣痛病菌及其类似病原菌的鉴别特征比较柑桔溃荡病citrusbacterial canker 病害名称柑桔斑点病(CBS)A型溃
20、荡病B型/C型/D型溃殇病柑桔黄单胞柑桔亚种棕色黄单胞莱稼亚种盲稽黄单胞积袖亚种新订学名Xanthomonas citri subsp. Xanthonmnas fusca5 Xanthomonas alfalfae (拉丁名)Citri Gabriel et. al (1 989) subsp. aurantifolii Gabriel et. subsp. Citromelonis al. ,(1989) Gabriel et. al. ,(1989) 地理分布亚洲、非洲、南美各国阿根廷、巴拉圭、乌拉圭;巴美国佛罗里达州西、墨西哥寄主范围葡萄袖、甜橙、袖、拧橡、积属拧模、酸橙、墨西哥菜稼橙
21、、桔、袖等多种柑桔幼苗初期形成突起小瘪斑;后期形初期形成小的痛斑;后期形成病害症状成木栓化粗糙，两面隆起病斑，木栓化粗糙，隆起病斑，后期病叶片病斑扁平或下陷，病有时病斑边缘袖圈明显，外国呈斑隆起，病斑边缘呈水渍状斑边缘水渍状明显水渍状在YDC上，28C -30 .C培养在YDC上，28c -30C培养在YDC上，28c -30 c 培养特性40 h-44 h形成单菌落;不产生56 h-60 h形成单菌落，可产生培养30h-34 h形成单菌水溶性褐色素水溶性褐色素落，可产生水溶性褐色素7 GB/T 28068-2011 表A.1(续)柑桔溃荡病citrus bacterial canker 病害
22、名称柑桔斑点病CCBS)A型溃荡病B型/C型/D型溃荡病利用麦芽糖，阿拉伯糖，不能利用菊糖;可碱性水解石蕃牛不能利用麦芽糖，可沉淀石恋能利用菊糖，使纤维二乳，可水解酶阮牛乳，不能水解酶阮糖、甘露酶产酸鉴别特征对CPl、CP2噬菌体敏感对CPl、CP2噬菌体不敏感对CPl、CP2噬菌体不敏感血清学反应呈阳性与柑桔亚种抗体血清学反应与柑桔亚种抗体血清学有差异反应呈阴性8 GB/T 28068-2011 附录B(资料性附录)柑桔溃痛病菌柑桔亚种和褐色亚种的常规PCR检测B.1 采样及样晶制备同柑桔溃瘸病实时荧光PCR。B.2 PCR扩增B. 2.1 扩增引物根据柑桔溃瘤病菌专有的保守蛋白基因设计通用
23、引物对XccF05/XccR05，序列分别为5-TTC GGC GTC AAC AAC CTG-3 /5-AAC TCC AGC ACA TAC GGG TC-3(扩增柑桔溃痛病菌保守蛋白基因序列413b抖。用元菌超纯水配制25mol/L母疲。B.2.2 扩增体系配制常规PCR反应液，25L反应体系，各种成分终浓度为:如192十dNTP Taq酶引物各PCR缓冲液(pH9.1)B.2.3 加样2 mmol/L 200mol/L 1 U/25L 0.5mol lX 取PCR反应管，每管中加入PCR反应液23L，再分别加入2L待测样品浸出液。同时以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2L/每管代
24、替待测模板作为对照。盖紧管盖，3OOOg瞬时离心，以混匀并去除气泡;转移至PCR，扩增区。B.2.4 PCR扩增设置好各反应管在定量PCR仪上的孔位并做好标记记录，按照预设孔位将各检测样品及对照放人常规PCR检测仪内进行PCR扩增。扩增程序为(不同PCR仪可能稍有差异)95 .C裂解变性4 min 94.CDNA变性30 s 58 .C退火30 s 72 oC延伸30 s 72 .C延伸7 min B.3 扩增产物检测PCR反应结束后，各反应管取10L扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，另一泳道加DNAMarker GB/T 28068一20门(100 bp DNA Ladder) 0 100 V
25、电压下电泳30mino 电泳后的凝胶经GoldViewer荧光染料染色后，在凝肢成像系统上观察分析并拍照电泳结果。B.4 结果判定B. 4.1 质控标准阳性凝胶图像阳性对照出现413bp左右特征性扩增条带，阴性对照、空白对照无此条带。B.4.2 阳性凝胶图像样品泳道中出现413bp左右特征性扩增条带，阳性对照、阴性对照、空白对照正常，判定样品为阳性，表示样品中带有柑桔溃痛病柑桔亚种或褐色亚种。B.4.3 阴性凝胶图像样品泳道中没有特异扩增条带，阳性对照、阴性对照、空白对照正常，判定样品为阴性，表示样品中不带可检出的柑桔溃癌病柑桔亚种和褐色亚种。10 GB/T 28068-2011 附录C(规范
26、性附录)柑桔溃痛病菌检测试剂配制和样品制备C.1 样品制备试剂C. 1. 1 0.01 mol/L磷酸缓冲撞(pH7.2)PBS缓冲波A液:0.2mol/L磷酸二氢铀水溶液，NaH2P04 H20 27.6 g，溶于蒸馆水中，定容至1000 mLo B液:0.2mol/L磷酸氢二纳水溶液，Na2HP04 7H20 53. 6 g，(或Na2HP04 12H20 71. 6 g，或Na2 HP04 2H20 35.6 g)加蒸馆水溶解，定容至1000 mLo 将0.2mol/L A液14mL与0.2mol/L B液36mL混合均匀即成0.01mol/L磷酸缓冲液。C. 1. 2 TE缓冲液取0.
27、1mol/L Tris-HCl CpH7. 4) 20 mL，加入0.5mol!L EDTA CpH8.0) 40 mL，用灭菌超纯水定容至200mL, 4 oC保存。C.2 样品制备C. 2.1 工作台及操作者消毒灭茵样品处理在超净工作台或生物安全柜中进行。工作台和操作者双手应消毒灭菌。C.2.2 疑似症状柑桔样品制备切取柑桔组织表面的溃癌病疑似病斑，放入1.5 r此微量离心管中，加入PBS液500L，室温条件下漫泡20min，经8000g离心5min，弃去上清液，以试管底部残液(约100L)直接作为待测模板。C.2.3 无症柑桔样晶制备对需检测的元症材料，取植物组织5g10 g，用10mL
28、20 mL PBS液浸泡，150r/min富集振荡培养1h1. 5 h , 10 000 g离心5min，弃去上清液，以试管底部残存液(约500L)经微滤柱过滤，以200LTE缓冲液再次洗涤离心，去滤液。最后以100LTE缓冲液将滤膜上的菌体洗脱，洗脱液作为待测模板。C.2.4 阳性对照配制按照C.2. 2方法以典型柑桔溃踌病病斑制备浸出液、或经致病性验证的柑桔溃痛病菌纯培养、或以柑桔溃弱病菌特异DNA序列元害化重组质粒DNA作为阳性对照。C.2.5 阴性对照按照C.2. 3方法制备健康柑桔植株叶片浸出液作为阴性对照。11 GB/T 28068-20门附录D(规范性附录)柑桔溃痛病菌PCR检测
29、操作程序D.1 扩增试剂配制(在反应试剂配制区进行)D. 1. 1 用无菌超纯水配制25mol/L柑桔溃癌病菌特异性引物对母液(用于荧光染料法，引物序列为CQUXcc F02: 5人ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3，CQUXcc R02: 5 -TCTGACCACATCGCAT AGGA-3 ，扩增柑桔渍瘸病菌特异性基因序列为278bp)。D. 1.2 用元菌超纯水配制25mol/L柑桔溃癌病菌特异性引物对CQUXccF 06/CQUXcc R 06母液(用于荧光探针法，引物序列为CQUXccF06: 5人GCGGCTATTGGCTGACTTCA-3和CQUXccR 06: 5人G
30、TAGGGCGGACCTT GGGAT-3，扩增柑桔溃瘸病菌特异性基因序列为119bp)。D. 1. 3 以无菌超纯水配制25mol/L荧光标记探针CQUXccPl母液(序列为5-TCCTCCA T AAC GAACTCGCAAGGCAC3勺。D.2 加样(反应体系为25J1L) D. 2.1 方法1试剂盒方法(推荐方法)从固相化试剂盒中取出0.2mL PCR固相化试剂检测管，管中分别加入23L样品恢复液，再在不同管中分别加入2L待测样品DNA液、阳性对照、阴性对照、空白对照(灭菌超纯水)，盖紧管盖，转移至PCR反应区。D.2.2 方法2自配试剂方法D. 2. 2.1 荧光染料法D. 2. 2
31、. 1. 1 加入引物对CQUXccF02/CQUXcc R02母液到荧光PCRMaster Mix(含dNTPs、Mg2+, 热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液、SYBRGreen 1荧光染料)中，加灭菌超纯水使反应液中引物终浓度为0.25mol/L，1 X PCR Master Mix，棍匀。D. 2. 2.1.2 取0.2mL PCR反应管，编号后每管中加入23L上步所配反应液。D. 2. 2. 1. 3 分别加入待测样品液2L/每管F以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2L/每管代替待测模板作为对照。盖紧管盖，3000 g瞬时离心，以混匀并去除气泡。D. 2. 2.1.4 转移至PC
32、R反应区。D. 2. 2. 2 荧光探针法D. 2. 2. 2. 1 在避光条件下加入荧光标记探针CQUXCCPj母液和引物对CQUXccF 06/CQUXccR06 母液到PCRMaster Mix (含dNTPs、Mg2+、热启动DNA聚合酶、PCR缓冲液)中，使引物终浓度为0.3mol/L，探针浓度为0.2mol/L，lX PCR Master Mix，混匀。D. 2. 2. 2. 2 分别加入待测样品液2L/每管;以新鲜制备的阴性对照、阳性对照和空白对照2L/每管代替待测样品作为对照，盖紧管盖，3000 g瞬时离心，以混匀并去除气泡。D. 2. 2. 2. 3 转移至PCR检测区。GB
33、/T 28068-2011 D.3 实时荧光PCR扩增(在检测区进行)D. 3.1 荧光染料法PCR扩增D. 3. 1. 1 扩增程序在iCycler(Bio-Rad，USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化): 二-95.C裂解&酶活性热启动4min，一个循环(X1); 94.C变性15s , 61 .C退火，72.C延伸30s，共40个循环(X40)，在每个循环的延伸阶段72.C 时采集荧光10S; 末次延伸72.C , 7 min。. D. 3. 1. 2 嬉解曲线分析PCR扩增结束后立即进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。熔解曲线反应程序为
34、:97 .C , 1 min; 57 .C , 1 min;从57.C开始每升高0.5.C保持10s，升高到97.C止。验证检测结束后，设备自动记录并生成报告。根据仪器采集荧光曲线和Ct值判定结果。D.3.2 荧光探针法PCR扩增在iCycler(Bio-Rad , USA)实时荧光PCR仪上进行的扩增程序为(其他型号PCR仪扩增程序参数可能稍有变化): 一一95.C变性&酶活性热启动4min，l个循环;一一94.C变性15s , 61 .C退火，72.C延伸30s，共计40个循环(X40)，在每个循环的延伸阶段(72 .C)同步采集荧光;一一末次延伸72.C , 7 mino 检测结束后，设
35、备自动记录并生成报告。根据仪器采集的荧光曲线和Ct值判定结果。13 GB/T 28068一2011附录E(资料性附录)柑桔遣痛病菌实时荧光PCR检测试剂盒组成及使用说明E.1 检测试剂盒组成每个试剂盒最多可检测48个样品，包括以下成分z一一样品制备液一一固相试剂恢复液一一阳性对照(无害化Xacc特异序列重组质粒DNA)一一阴性对照(健康柑桔植株DNA)一一同相化试剂检测管E.2 兑明E. 2.1 样品制备液的主要成分为磷酸缓冲液。E. 2. 2 恢复液用于溶解荧光PCR固相化混合试剂。30 mLX4瓶50LX4支20 ngX5支20 ngX5支8联管X6条E. 2. 3 用于荧光染料法检测的固
36、相试剂管中包含除待测样品DNA外的所有PCR扩增反应试剂及荧光染料，用于荧光探针检测的固相化试剂反应管中包含除待测模板DNA外的所有PCR反应试剂及荧光探针。E.3 功能所列试剂盒可用于柑桔溃窃病叶片、枝条和果实等组织材料样品中柑桔溃癌病菌的实时荧光PCR检测和病害鉴定。具体操作按使用说明进行。E.4 使用注意事项E. 4.1 发生褐变的柑桔组织材料不宜作为PCR检测样品。E. 4. 2 在制样及检测过程中，应严格防范不同样品间的交叉污染，所有用具应彻底清洗并消毒z移液器头尖应一次性使用，并且转移每个样品时都应更换，以免交叉污染。E. 4. 3 上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染
37、仪器，反应管内避免产生气泡。E. 4. 4 全部检测过程可在室温(23.C)下进行，PCR固相化试剂盒可以在室温条件下置于干燥器内密封保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。14 FFON|ONH阁。华人民共和国家标准柑桔溃痛病菌实时荧光PCR检测方法GB/T 28068-2011 国中* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷印张1.25 字数26千字2012年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年5月第一版* 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价书号:155066. 1-44580 GB/T 28068-2011 打印日期:2012年5月22日F002
