1、ICS 65.020.01 B 16 aB 中华人民共和国国家标准GB/T 28080-20门小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Tilletia indica Mitra 2011-12-30发布数码Ijj伪/中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2012-06-01实施发布GB/T 28080-2011 目次前言.Il 范围2 规范性引用文件-3 小麦印度腥黑穗病菌基本信息4 方法原理.5 检疫鉴定流程-6 取样方法6.1 未经加工小麦取样方法-6.2 加工小麦取样方法.6.3 袋装面粉抽样比例7 主要仪器设
2、备和试剂7.1 主要仪器设备7.2 主要试剂.48 检测与鉴定.4 8. 1 样品前处理.4 8.2 形态学鉴定8.3 单个冬抱子直接分子检测.8.4 于包子培养物的分子检测8.5 序列测定与比对9 结果判断与表述.9.1 形态学鉴定结果判断和表述9.2 单个抱子直接分子检测结果判断和表述-9.3 抱子培养物分子检测结果判断和表述9.4 序列测定与比对10 样品和原始数据保存10. 1 样品保存10.2 原始数据保存附录A(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息附录B(规范性附录)形态学鉴定附录C(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的抱子显微形态图和扫描形态图.10 附录D(规范性附录)单
3、个冬抱子直接分子检测.附录E(规范性附录)抱子培养物常规PCR检测 14 附录F(规范性附录)抱子培养物实时荧光PCR检测附录G(规范性附录)序列测定与比对.GB/T 28080-2011 目U昌本标准按照GB/T1. 1一2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:章桂明、程颖慧、王颖、陆清、凌杏元、龙海、陈枝楠、向才玉、杨伟东、缪建键。I GB/T 28080-2011 小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌的检疫鉴
4、定方法，包括形态学方法和分子生物学检测方法，规定了小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程，明确了取样和样品保存方法。本标准适用于小麦及其加工产品传带的小麦印度腥黑穗病菌的检测。本标准也适用于除小麦以外的该病菌其他寄主传带小麦印度腥黑穗病菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18085 植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求3 小麦印度腥黑穗病菌基本
5、信息中文名:小麦印度腥黑穗病菌。学名:Tilletia indica Mitra。异名:Neovossia indica (Mitra) Mundkur。病害英文名:karnal bunt of wheat(简称KB), partial bunt of wheat。属真菌界Fungi、担子菌门Basidiomycota、黑粉菌纲Ustomycetes、黑粉菌目Ustilaginales、腥黑粉菌科Tilletiaceae、腥黑粉菌属Tilletiao小麦印度腥黑穗病菌主要通过发病种子和附着于健康种子表面的冬抱子进行远距离传播，也可随土壤及其他农用工具进行传播。小麦印度腥黑穗病菌的其他信息参见附
6、录Ao4 方法原理根据小麦印度腥黑穗病菌的生物学和形态学特征以及分子生物学特征，应用相关仪器，包括显微镜和PCR仪等对小麦印度腥黑穗病菌进行鉴定。5 检疫鉴定流程检疫鉴定流程见图1。1 GB/T 28080-2011 判定为不带KB抱子镜检序列测定与比对实时荧光Rm检测常规咱们饲检测菌瘦或洗涤检验抱子平均值在25m-35m 间做分子检测小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定流程图图12 G/T 28080-2011 6 取样方法6. 1 未经加工小麦取样方法按照GB/T18085取样方法进行取样。6.2 加工小麦取样方法实施堆垛抽样时，在堆垛四周按正弦曲线从上、中、下层随机确定抽样点。实施船舱内货物抽样时
7、，以50m2为一个抽样区，每区设中心及四角(距边缘1m处)五个抽样点，每增加一个抽样区，增加三个抽样点。集装箱或车厢装载的麦款、面粉抽样参照船舱抽样方法进行。6.3 袋装面粉抽样比例10袋以下，逐袋抽样。10100袋，随机取10件。100袋以上，按一批货物总袋数的平方根数抽取见式(1)。视工J百式中zN 一批货物的总袋数;n一一应抽取件数(n值取整数，小数部分向上修约)。7 主要仪器设备和试剂7. 1 主要仪器设备7. 1. 1 摇床。7.1.2 显微镜。7. 1. 3 纯水器。7. 1. 4 测序仪。7. 1. 5 电泳仪。7. 1.6 低温冰箱。7. 1.7 显微操作仪。7. 1. 8 超
8、净工作台。7.1.9 高压灭菌锅。7. 1. 10 光照培养箱。7. 1. 11 旋涡振荡器。7. 1. 12 普通离心机。7. 1. 13 冷冻干燥机。7. 1. 14 凝胶成像仪。7. 1. 15 核酸蛋白分析仪。7.1.16 PCR仪(常规PCR仪、实时荧光PCR仪)。7. 1. 17 破壁针(具有平截切面的针，能将抱子压碎)。7. 1. 18 培养皿(9cm)。. ( 1 ) 3 GB/T 28080-20门7.1.19筛网(53m、20m)。7. 1. 20 孔径100m的毛细管。7. 1. 21 锥形瓶(250mL、500mL)。7. 1.22 盖玻片(18mmX 18 mm)。7
9、. 1. 23 PCR反应管(0.2mL,O. 5 mL)。7. 1. 24 载玻片(25mmX 76 mm，厚(0.8 mm1. 0 mm)。7. 1. 25 Tip头(0.1L10L，5L200L，100Ll000L)。7. 1. 26 可调微量移液器(2L，10L，20L，100L，200L，1000L)。7.2 主要试剂7.2.1 二氯甲烧。7.2.2 异戊醇。7.2.3 异丙醇。7.2.4 醋酸铀。7.2.5 甲酷肢。7.2.6 70%乙醇。7.2.7 元水乙醇。7.2.8 Tris饱和酣。7.2.9 Taq酶。7.2.10 Gelatin o 7.2. 11 澳化乙链。7.2.12
10、 DNA Marker。7.2.13 PDA培养基。7.2.14 水琼脂培养基。7.2.15 SDS提取液。7.2.16 PCR缓冲液。7.2. 17 电泳缓冲液。7.2. 18 上样缓冲液。7.2. 19 Bigdye试剂盒。7.2.20 TaqMan Universal PCR Master Mixo 7.2.21 席尔氏浮载剂，见GB/T18085。7.2.22 dNTPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。注:除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。8 检测与鉴定8. 1 样晶前处理8. 1. 1 实验室器皿和筛罔的前处理将所有实验器皿和筛网浸泡于1.6%的次氯酸铀中15
11、min，然后用元菌水冲洗5次。8. 1. 2 面粉中范子的获取将面粉样品充分混匀，称取50g置于250mL锥形瓶中，加入100mL元菌水，搅拌均匀后倒入直径4 GB/T 28080-2011 为9cm的玻璃培养皿中，使面粉溶液在培养皿中均匀成一薄层，再将培养皿置于解剖镜下镜检，用解剖针挑取深色冬抱子用于形态学鉴定或分子生物学检测。8.2 形态学鉴定对查找到菌瘦，或通过洗涤检验获得冬抱子的，先进行形态学鉴定。对菌瘦采用解剖针挑取菌瘦的冬抱子，置于席尔氏液中制片，对洗涤检验采用滴管吸取冬抱子悬浮液制片，待冬抱子胶质辅充分展开后，进行封片，观察冬抱子的大小、形状、颜色、外抱壁结构，在100X油镜下测
12、量冬抱子的大小，每个样品测量100个冬抱子。形态学鉴定的具体操作过程见附录B，KB与近似种的形态学图参照附录Co8.3 单个各强子直接分子检测对未查找到菌瘦，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌冬抱子的，要进行单个抱子分子方法检测。每个PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。每次PCR检测应设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。单个冬抱子直接分子检测具体操作过程见附录D。8.4 抱子培养物的分子检翻对未查找到菌瘦，但通过洗涤检验发现疑似小麦印度腥黑穗病菌，而这些疑似小麦印度腥黑穗病菌通过形态学和单个抱子检测无法获得准确结果时，则要对抱子进行培养(培养方法见E.l)，用培养物进行分子检
13、测。每次PCR检测须设立相应的阳性对照、阴性对照和空白对照。于包子培养物分子检测具体操作过程见附录E、附录F。8.5 序列测定与比对将PCR产物纯化后，进行测序，或由生物公司完成。把测序所得到的核昔酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对。序列比对具体操作过程见附录G。9 结果判断与表述9. 1 形态学鉴定结果判断和表述对查找到的菌瘦中的冬抱子或通过洗涤检验获取的冬抱子，所观察的症状和形态学特征与小麦印度腥黑穗病菌冬抱子的一致，且对其100个抱子大小测量平均值大于35rn，则判定该样品含有小麦印度腥黑穗病菌;对其100个抱于大小测量平均值小于25m，则判定该样品不含有小麦印度腥黑穗病菌
14、;对其100个抱子大小测量平均值介于25m35m，则判定该样品含有疑似小麦印度腥黑穗病菌，应进行进一步分子检测。9.2 单个强子直接分子检测结果判断和表述9.2. 1 常规PCR检测结果判断和表述对单个抱子进行PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如通过电泳获取260bp条带，且测序比对与小麦印度腥黑穗病菌一致的判定为该样品含有小麦印度腥黑穗病菌;如没有PCR扩增条带的则应挑取抱子进行萌发，进行分子检测。5 GR/T 28080一20门9.2.2 实时荧光PCR检测结果判断和表述对单个抱子进行MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下
15、，则:检测Ct值小于或等于36，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性;一一一检测Ct值大于36，应重做实时荧光PCR，如再次扩增后，Ct值小于或等于36，判定同上，如Ct值大于36，则需要挑取冬抱子进行萌发，用抱子培养物进行分子检测。9.3 抱子培养物分子检测结果判断和表述9.3. 1 常规PCR检测结果判断和表述对抱子培养物进行常规PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品扩增产生414bp(引物Tin3/Tin4)或260bp(引物P12)的特异性条带，则初步判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性，但需进一步进行实时荧光PCR检测或序列测定与比对进行结果验证，按照实
16、时荧光PCR检测或序列测定与比对结果进行最后结果判定;如样品无特异性扩增条带，则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。9.3.2 实时荧光PCR检测结果判断和表述9.3.2. 1 普通探针实时荧光PCR检测结果判断和表述普通探针的实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:检测Ct值小于34，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性;一一检测Ct值大于或等于34，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。9.3.2.2 MGB探针实时荧光PCR检测结果判断和表述MGB探针实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则:检测Ct值小于或等于36，判
17、定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性;一一检测Ct值大于或等于40，判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性;一一检测Ct值在3640之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后，如Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上。9.4 序列测定与比对把测序所得到的核昔酸序列与已知的小麦印度腥黑穗病菌相应序列进行比对，如果与已知的小麦印度腥黑穗病菌序列完全一致，则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阳性，不一致则判定小麦印度腥黑穗病菌检测结果呈阴性。10 样品和原始数据保存10. 1 样晶保存存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现小麦印度腥黑穗病菌，该样品应保存1年，以备复验
18、，如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。10.2 原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。6 附录A(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌其他信息A.l 分布小麦印度腥黑穗病大多分布于亚洲、北美洲、南美洲和非洲等少数几个国家。亚洲:印度、阿富汗、巴基斯坦、伊拉克、尼泊尔。北美洲z墨西哥、美国。南美洲:巴西。非洲z南非。A.2 形态特征G/T 28080-20门病菌冬抱子堆Csporemass)粉状，褐黑色，由冬抱子及不孕细胞组成，新鲜时有恶臭。不孕细胞球形至长椭圆形，常呈泪珠状，淡黄色至淡黄褐色，具有光滑而厚的裂片状
19、的胞壁，并常有一个菌丝附属丝。冬抱子元辅，有时具有一个菌丝附属丝，球形或近球形，红褐色(几乎不透光)，直径25m43m(平均35m)，抱壁疵刺状，疵突截形，1.5m5m。A.3 寄主范围及症状小麦印度腥黑穗病菌自然寄主为小麦CTriticumaestivum)、硬粒小麦CTriticumdurum)及小黑麦C Triticum aestivum X Secale cereale)。在人工接种条件下，尚可感染下列寄主植物:耐酸草CBromusciliatus)、旱雀麦CB.tectorum)、加那利黑麦草CLoliumcanariense)、意大利黑麦草CL.multiflorum)、黑麦草CL
20、.erenne)、波斯黑麦草CL.ersicum)、一粒小麦CTriticum monococcum)、野生一粒小麦CTriticum boeticum)、提莫非氏小麦CTriticumtimopheevi)、Triticum0heeri、黑麦CSecale cereale) ; 山羊草属CAegilos):二角山羊草CA.bicornis)、尾状山羊草CA.caudata)、顶芒山羊草CA.comosa)、A. mutica、A.searsii、沙伦山羊草CA. sharonensis)、粗山羊草CA. tauschii)、A.triaristana、A. triunciale等。小麦印度腥
21、黑穗病菌主要为害小麦穗部。其症状特点是对寄主穗部的局部侵染，当感病小麦进入糊熟期时，开始出现症状，在有的品种上，病穗一般较健穗短，感病麦株通常表现为部分麦穗发病，感病麦穗也常表现为部分小穗受到感染，病穗通常局部黑粉化。成熟时在受害籽粒的腹沟处果皮下形成黑粉菌腔。感病轻微的，腹沟症状不明显，仅在子粒表面形成暗褐色殖斑，种子发芽率不受影响;感病严重时则病粒全部或大部分形成黑粉腔，外表由菌体化果皮包被，病菌损伤胚及毗邻的胚乳，种子不发芽或虽发芽只形成畸形弱苗;病粒中的黑粉由于病原菌产生三甲胶而散发出腐鱼腥臭味。病菌于包子堆形成于子房中，轻微膨胀或不膨胀，几乎完全为颖片所覆盖。A.4 传播途径病粒及附
22、着于健康种子表面的冬抱子是病原菌进行远距离传播的主要途径，由于该病局部侵染的GB/T 28080-2011 特性，在收获期间很难有效的清除混杂于健康种子中的病粒，因而病粒可随同贸易性小麦或资源性引种或科研性引种而进行远距离传播。在小麦收获期间，散落到土壤中的菌瘦或从破碎菌瘦中落入土壤中的小麦印度腥黑穗病菌冬抱子，随同土壤进行传播。带有抱子的病土也可通过秸附在人、牲畜和农用收获机械等表面进行传播。8 B.1 菌睡查找附录B(规范性附录)形态学鉴定GB/T 28080-2011 在体视显微镜下，检查小麦种子中有元菌瘦。感病较重的种子，菌瘦颜色多呈暗紫褐色，不同于健康种子，感病种子因腥黑粉菌抱子而散
23、发出三甲股气味。感病轻微的种子，可采用将小麦种子浸泡在水中检查菌瘦，即z将待检种子浸泡在水中，沿种子腹面对内碍进行观察。B.2 洗涤检验B.2.1 取50g样品放入250mL锥形瓶中，加入100mL元菌双蒸水(含0.01%Tween-20)，放于摇床200 r/min振荡3min以便释放抱子。B. 2. 2 将洗涤液倒在上层的53m的筛网上，20m筛网在下层，进行抽滤，用500mL的锥形瓶接收滤液。B.2.3 用100mL无菌双蒸水冲洗250mL锥形瓶中样品2次，然后将洗海液倒在53m的筛网上，再用200mL 300 mL元菌双蒸水冲洗53m筛网，确保抱子从样品上分离。B.2.4 移去53m筛
24、网，将20m筛网倾斜成450，用元菌双蒸水冲洗将筛网上的抱子冲洗下来，然后将抱子洗涤液倒入离心管中，1000g离心3mino B. 2. 5 用移液管将上清液缓缓吸出，最后加入席尔氏液，定容至100L500L，混匀，镜检。B.3 形态学鉴定用解剖针挑起抱子，置于席尔氏液中制片，在显微镜下观察抱子的大小、形状、颜色和抱壁结构，在100X油镜下测量100个冬抱子的大小。B.4 结果判定形态学鉴定结果判定见9.109 GB/T 28080-20门附录C(资料性附录)小麦印度腥黑穗病菌与近似种的强子里微形态图和扫描形态圄C.l 小麦印度腥黑穗病菌抱子显微形态图(章桂明等，2005)参见图C.L穹供凡圄
25、C.l小麦印度腥黑穗病菌抱子里微形态图C.2 小麦印度腥黑穗病菌于包子电镜扫描形态图(章桂明等，2005)参见图C.2。图C.2小麦印度腥黑穗病菌弛子电镜扫描形态图10 GB/T 28080-2011 C.3 黑麦草腥黑穗病菌抱子显微形态图(EPPO，2004)参见图C.3。图C.3黑麦草腥黑穗病菌子包子显微形态图C.4 黑麦草腥黑穗病菌抱子电镜扫描形态图OimPlaskowitz , 2006)参见图C.4。图C.4黑麦草腥黑穗病菌于包子电镜扫描形态图11 GB/T 28080-2011 附录D(规范性附录)单个各抱子直接分子检测D.1 单个抱子核酸制备菌瘦中冬抱子获取方法:用针刺破菌瘦，挑
26、取不带植物组织的少许抱子，将这些抱子轻轻展布于载玻片上，在低倍镜下观察抱子是否分散开，再将单个抱子挑起，直接转移到PCR管的管盖中，在低倍镜下确认抱子是否已被成功放置。于包子悬浮液中冬子包子获取方法:用显微操作系统(或在倒置显微镜下人工操作)从抱子悬浮液中吸取抱子，所用毛细管孔径为100rn，整个操作过程在检测器上进行监控，也可在显微镜下直接进行观察，确认抱子己被吸人毛细管内并被转移到PCR管的管盖内。用破壁针对放置在PCR管盖中的抱子实施破壁:在10X低倍镜下用破壁针头轻轻挤压抱子，促使抱子壁破裂，使抱子中的核酸释放出来，在显微镜下检测抱子壁是否已经被压破。快速将PCR反应混合液加到PCR管
27、盖中，振荡混匀，然后离心，置于冰上，振荡后离心。D.2 分子生物学检测D. 2.1 常规PCR检测D. 2. 1. 1 常规PCR引物序列常规PCR引物序列为:正向引物P12-1:5-GTAATAGCCCTGTGCAGAAG-3 反向引物P12-2:5 -CGGCGAAGAAAGTCGGATTT-3 D. 2. 1. 2 常规PCR扩增体系及条件反应体系总体积为25L，各成分为:2.5L 10XPCR缓冲液Tris-HCl(pH8. 0) 10 rnrnol/L , Mg2+ 1. 5 rnrnol/L , KCl 50 rnrnol/LJ , 2L dNTPs (2. 5 rnrnol/L)
28、 , O. 25L各引物(10rnol/L), 0.3L Taq酶(5U/LL) , 2. 5 /LL Gelatin 0. 01 % (wt/vol门，无菌双蒸水17.2L。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为960C预变性3rnin，然后进入循环反应:96 oC变性15s , 57. 5 oC退火30s，720C延伸30 s，共70次循环，720C延伸10rnino D. 2.1.3 琼脂糖凝胶电泳每个样品取
29、5L的PCR产物与lL的6X上样缓冲液混合均匀，并加到含有澳化乙链(0.5g/rnL)的1.2%琼脂糖凝肢的点样孔中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝肢成像系统中观察、拍照，并保存照片。D.2.2 实时荧光PCR检测D. 2. 2.1 实时荧光PCR引物及探针序到实时荧光PCR引物及探针序列为:正向引物SZFP254-1:5 -AGCCATCACTGGAGTTGTCATC头3反向引物SZFP254-2:5人CCCAGCAAGGTCACCTTTGA-3 探针序列SZFPb255:5人FAM-CCGACCGTATCGGTCT-MGB-3 D.2.2.2 实时荧光PCR反应体系及条件G.B/T
30、28080-2011 反应体系总体积为5L，各成分为:实时荧光反应混合液2.5L TaqMan Universal PCR Master Mix，0.45L各引物(10tnol/L),0. 1L探针(10mol/L)，无菌双蒸水1.5L。将反应体系?昆匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个实时荧光PCR反应检测1个冬抱子，共检测5个冬抱子。用无菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50.C预热2m血，95.C变性10min.然后进入循环反应:95 .C变性15s , 60 .C延伸1 min，共40次循
31、环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。D.3 结果判定结果判定见9.2.13 GB/T 28080-20门附录E(规范性附录)于包子培养物常规PCR检测E. l 于包子萌发挑取冬抱子，置于2%水琼脂培养基上，18.C20 .C、每日连续光照12h条件下培养10d，解剖镜下检查萌发情况。对萌发的抱子用接种针挑取置于PDA培养基上，20.C22 .C培养20d. E.2 于包子培养物的核酸制备E. 2.1 称取0.1g培养物，放在元菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉未。E. 2. 2 立即转移到2mL的离心管中，加人65.C预
32、热的SDS提取液700L，置于水浴锅中65.C水浴30 min，期间不断混匀。E. 2. 3 加入5L10 mg/mL RNA酶，充分混匀，在37.C放置30mino E. 2. 4 加入等体积的Tris饱和酣，充分摇匀，在12000r/min下离心15min。E.2.5 取上清液，加入1: 1三氯甲:皖/异戊醇(24: 1)，在12000r/min下离心15min。E. 2. 6 再取上清液，加入1: 1三氯甲:皖/异戊醇(24: 1)，在12000r/min下离心15min。E. 2. 7 加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一200C冰箱静置30min，在12000 r/min下离心1
33、5 mino E. 2. 8 弃上清液，加入70%乙醇500L，12000 r/min下离心3min，去上清液，重复2次。E.2.9 得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加入-30L50LTE或无菌去离子水，充分洛解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一200C冰箱中保存。注:该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法。E.3 DNA纯度与浓度的测定用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算见式(E.1)和式(E.2): DNA纯度=OD260 /OD280 .( E.1 ) DNA浓度(g/mL)= 50 X OD260 . ( E.
34、2 ) PCR级DNA溶液的oD260 /0 D280比值为1.71. 90 E. 4 常规PCRE. 4.1 引物序列引物序列为:正向引物Tin3:5人CAATGTTGGCGTGGCGGCGC-3 反向引物Tin4:5-CAACTCCAGTGATGGCTCCG-3 也可以使用D.2.1中的P12引物。14 GB/T 28080-2011 E.4.2 扩增体系及条件引物Tin3/Tin 4的反应体系总体积为25L，各成分为:2. 5L 10 X PCR缓冲液Tris-HCl(pH8. 0) 10 mmol/L , Mg2+ 1. 5 mmol/L , KCl 50 mmol/LJ , 1L d
35、NTPs(10 mmol/L) ，0.1L各引物(25mol/L) ，0.1L AmpliTaq (5 U/L L) ，1L DNA(10 ng/ /LL) ，无菌双蒸水20.2L。将反应体系混匀，离心后置于PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为94.C预变性1min，然后进入循环反应:94.C变性15s , 65 .C退火15s，72.C延伸15s , 共25次循环，72.C延伸6min。引物P12的扩增体系和反应条件见D.2.1.2.E.5 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝肢
36、电泳见D.2. 1. 3。E.6 结果判定结果判定见9.3.1.15 GB/T 28080-20门附录F(规范性附录)于包子培养物实时荧光PCR检测F. 1 强子萌发抱子萌发见E.1。F.2 于包子培养物的核酸制备于包子培养物的核酸制备见E.2.F.3 DNA纯度与浓度的测定DNA纯度与浓度的测定见E.3。F.4 普通探针实时荧光PCR检测F.4.1 引物及探针序列引物及探针序列为:引物序列同E.4.1。探针序列为:5人FAM-A TTCCCGGCTTCGGCGTCACT -T AMRA-3 F.4.2 反应体系及条件反应体系总体积为25L，各成分为:实时荧光反应混合液12.5L TaqMan
37、 Universal PCR Master Mix, 1L各引物(10mol/L)，lL探针(10mol/L)，lLDNA (10 ng/LL)，元菌双蒸水8.5L。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50c预热2min , 95 c变性10min，然后进入循环反应:95 .C变性15s，60.C延伸1 min，共34次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。F.5 MGB探针实时荧光PCR检测F.5.1
38、 引物及探针序列引物及探针序列同D.2.2.LF.5.2 反应体系及条件反应体系总体积为5L，各成分分别为:实时荧光反应混合液2.5L TaqMan Universal PCR GB/T 28080-2011 Master Mix, O. 45L各引物(10mol/L),0. 1L探针(10mol/L)，1L DNA(1 0 ng /L)，元菌双蒸水O.5L。将反应体系混匀，离心后置于实时荧光PCR仪中进行反应，每个反应重复2次。用元菌双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有小麦印度腥黑穗病菌的DNA作为模板，阴性对照以其他腥黑穗病菌DNA作为模板。反应条件为50.C预热2min , 95 .C变性
39、10min，然后进入循环反应:95 .C变性15s，60.C延伸1 min，共40次循环。对实时荧光PCR仪的程序进行设置，使仪器能进行FAM荧光的检测。F.6 实时荧光PCR检测结果判定和表述实时荧光PCR检测结果判定和表述见9.3.2.17 GB/T 28080-2011 G.1 PCR扩增附录G规范性附录)序列测定与比对用rDNAITS片段PCR扩增方法如下:ITS4引物序列:5 -TCCTCCGCTT A TTGA T A TGC-3 ITS5引物序列:5 -GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3 反应体系总体积为25L，各成分为:2.5L 10X PCR缓冲液Tris-H
40、Cl(pH8. 0) 10 mmol/L , Mg2+ 1. 5 mmol/L , KCl 50 mmol/LJ , 2L dNTPs (2. 5 mmol/L) , 1. 25L各引物(10mol/L), 0.3L Taq酶(5U/L) ，1L DNA (1 0 ng/flL) ，元菌双蒸水16.7Lo反应条件为95c预变性10min，然后进入循环反应:95 oC变性30s , 58 oC退火30s, 72 oC延伸1 min，共35次循环，720C延伸7mino 电泳检测见D.2. 1. 3。对符合条件的PCR产物进行纯化，直接测序，具体操作步骤见相关试剂盒说明书。也可将PCR产物送到生物
41、公司进行测序。也可以用附录D、附录E中的常规PCR引物进行PCR扩增。G.2 序列比对把测序所得的核昔酸序列与己知的小麦印度腥黑穗病菌的相对应的序列进行比对。G.3 结果判定结果判定见9.4018 -FON|OONH目。华人民共和国家标准小麦印度腥黑穗病菌检瘟鉴定方法GB/T 28080-2011 国申* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1.5字数39千字2012年4月第一版2012年4月第一次印刷 书号:155066. 1-44636 24.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 28080-2011 打印日期:2012年5月22R F002
