1、ICS 65.020.01 B 16 GB 和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 28106-2011 ， /r、/r川、it-. 、/由.，(坠，1、?匀，, 郁金香黄色痕斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Curtobacterium flaccumfaciens pV. oortii Collins & Jones 2011-12-30发布2012-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会发布目lJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会
2、(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局。G/T 28106-2011 本标准主要起草人:郭京泽、魏亚东、张裕君、刘跃庭、刘鹏、罗加凤、廖芳、王金成。I GB/T 28106-2011 郁金香黄色癌斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了郁金香黄色殖斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于栽培及其他用途的郁金香球茎、郁金香植株上郁金香黄色痛斑病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789. 28-
3、2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 郁金香黄色癌斑病菌基本信息中文名:郁金香黄色痞斑病菌。学名:Curtobacterium jZaccumfaciens pv. oortii 0 异名:Corynebacterium jZaccumfaciens pv. oortii (Saaltink &. Maas Geesteranus 1969) Dye &. Kemp 1977 , Corynebacterium flaccumfaciens subsp. oortii (Saaltink &. Maas Geesteranus 1
4、969) Carlson &. Vidaver 1982 ,Corynebacterium oortii Saaltink &. Maas Geesteranus 19690 病害英文名:tulip bacterial canker, tulip yellow pustule 0 属原核生物界Procaryotes，厚壁菌门Firmicutes，厚壁细菌纲Firmibacteria，短小杆菌属Curtobactenu20 该病菌随带病球茎调运远距离传播。带病球茎通过无性繁育将该病菌传播给子球。植株间通过带菌病叶扩散传播。郁金香黄色殖斑病菌其他信息参见附录Ao4 方法原理从病部样品中分离病菌并纯
5、化，然后通过革兰氏染色、生理生化测定进行该病原细菌的鉴定。郁金香黄色殖斑病菌的寄主范围、病害症状特征、生物学特性、生理生化特性(参见附录A和附录B)是该病菌的检疫鉴定依据。5 仪器、设备生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、八道移液器，BIOLOG细菌自动鉴定系统。6 试剂和培养基无水乙醇、微量发酵管、革兰氏染色液。1 GB/T 28106-2011 523培养基:蛋白陈8g，酵母粉4g，硫酸镜(MgS047H20)0.3 g，蔚糖(C12H22 011) 10 g，磷酸氢二饵(K2HP04)2g，琼脂18g，水(H20)1000 mL。调整pH值至7.07.1，121 oC湿热灭菌
6、20mino BUG培养基。7 对照菌株已知标准菌株作阳性对照菌。选用本属不同种的菌株作为阴性对照菌。8 检测鉴定8. 1 现场检测按照SN/T2122的规定进行检疫并抽取样品。若发现郁金香病株矮化，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，球茎最外层鳞片上出现白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄(参见A.3)，应取样带回实验室做病菌分离鉴定。8.2 病原菌分离取带病样品，用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭表面，晾干或用灭菌水冲洗3次。切取病健交界部位组织置于灭菌的培养皿中加少量灭菌生理盐水，用玻棒碾碎，用接种环蘸取悬液在523培养基平板上进行划线分离。每个样品接种不少于3个平板。接种后的平板置于3
7、00C培养箱中培养24h72 h，检查出现的菌落情况。8.3 分离菌的纯化观察523培养革平板上产生的菌落，有黄色、有光泽、圆形、边缘整齐、直径1mml. 5 mm的菌落为可疑菌落。挑取单个可疑菌落，在523培养基平板上划线，接种后的平板置于30oC培养箱中培养24h72 h。一般连续转接2大3次可得到纯化的分离菌。8.4 革兰氏染色按GB/T4789.28-2003中2.2规定的方法进行。8.5 生理生化测定从郁金香上分离纯化的细菌经过革兰氏染色测定后，若分离菌为革兰氏染色阳性菌，则结合实验条件任选下列种方法对分离菌进行生理生化测定:应用BIOLOG细菌自动鉴定系统对分离菌进行生理生化测定。
8、按照BIOLOG细菌自动鉴定系统规定的操作方法进行，鉴定结果为Curtobacteriumflac口tmfaciens，则判定该分离菌的BIOLOG鉴定结果为阳性;应用微量发酵管对分离菌进行生理生化测定。测定结果与表B.1结果一致，则生理生化测定结果为阳性。否则生理生化测定结果为阴性。9 结果评定从郁金香上进行细菌分离纯化，若分离菌经过革兰氏染色为阴性菌，则判定检测结果为样品不带郁金香黄色殖斑病菌。GB/T 28106-2011 从郁金香上进行细菌分离纯化，分离菌经过革兰氏染色为阳性菌，BIOLOG鉴定结果为阳性，或用微量发酵管进行生理生化测定其结果为阳性，则判定检验样品带有郁金香黄色殖斑病菌
9、。否则判定检验样品不带郁金香黄色殖斑病菌。10 菌株和样晶的保存分离并鉴定为郁金香黄色痛斑病菌的菌株应转接到523培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4oc低温冰箱中保存，定期转接，以防止病菌死亡;必要时冻干后长期保存。检出郁金香黄色痞斑病菌的样品至少保存6个月;保存期满后，需经灭菌处理。3 GB/T 28106-2011 附录A(资料性附录)郁金香黄色癌斑病菌其他信息A.1 分布丹麦、荷兰、罗马尼亚、英国、日本、韩国，在我国台湾和杭州有报道。A.2 寄主范围郁金香(Tuligesneriana)。A.3 危害症状郁金香黄色癌斑病菌能系统性侵染郁金香，引起郁金香维管束病害，造成郁金香植株
10、叶斑和郁金香球茎黄色癌斑。感染郁金香黄色殖斑病菌的郁金香病株严重时可出现矮化症状，叶片出现银灰色斑，上下表皮开裂，茎杆内部变黄，郁金香球茎最外层鳞片上出现白色斑，在球茎储藏后期病斑隆起变黄。在春季温度低时易于发病。A.4 生物学特性菌体杆状，大小(0.4m0.6m)X (0. 6m3.0m);周生鞭毛，革兰氏染色阳性，最适生长温度为25.C 30 .C。能水解酷蛋白，能利用乳酸、苹果酸、葡萄糖酸、醋酸盐，不能利用阿拉伯糖、山梨糖、蔚糖、丙酸、甲酸盐。4 GB/T 28106-2011 附录B(规范性附录)郁金香黄色癌斑病菌的生理生化特性表B.1郁金香黄色植斑病菌的生理生化特性Curtobact
11、erium 项目flaccumfaciens C. albidum C. citreum C. luteum C. plantarum C.usiZZ四mC. jZaccumfaciens pv. batae pv.oortzz 醋蛋白水解十十+ 十树胶fI糖产酸十W十Wd 十W山梨糖产酸+W 煎糖产酸十W乳酸同化十十+ ND + + 苹果酸同化+ + 十d 十葡萄糖酸同化十+ + + + + 醋酸盐利用+ 注2十:90%以上菌株为阳性;-:90%以上菌株为阴性叫:11%-89%菌株为阳性;W:弱反应;ND:未测定。5 =oN|OFRH阁。华人民共和国家标准郁金香黄色癌斑病菌检疫鉴定方法GB/T 28106-2011 国由 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张0.75字数11千字2012年4月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2012年4月第一版* 书号:155066. 1-44658 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价1111 打印H期:2012年5月22H F002
