1、每!ICS 67.120.30 X 20 共和国国家标准中华人民GB/T 31520-2015 红球藻中虾青素的测定?在相色谱法Determination of astaxanthin in Haematococcus High performance liquid chromatography method 2015-05-15实施2015白05-15发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会电飞，、/叫m川/叭中GB/T 31520-2015 前本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。_._ = F习本标准由全国水产标
2、准化技术委员会水产品如工分技术委员会(SAC/TC156/SC 3)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、云南爱尔发生物技术有限公司。本标准主要起草人z孙伟红、张勇、冷凯良、徐春媚、刘建国、吴秋瑾、邢丽红、苗均魁、肖荣辉、孙来蝉、瞿毓秀、许洋。I GB/T 31520-2015 1 范围红球藻中虾青素的测定液相色谱法本标准规定了红球藻(flatococcus)中虾青素的被相色谱测定方法。本标准适用于雨生红球藻(flaematococcusluvialis)藻粉中虾青素含量的测定，2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于
3、本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样经二氯甲烧与甲醇混合溶掖提取，氢氧化铀甲薛禧被皂化，使其中的虾青素醋转化成带离态的虾青素，经C30反相液相色谱柱分离后，用配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。4 试剂所用试剂除另有规定外均为色谱纯。4.1 试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。4.2 丙酣。4.3 磷酸z优级纯。4.4 氢氧化铀z优级纯。4.5 甲晖。4.6 二氯甲烧。4.7 叔丁基甲基瞌.4.8 2，6-二叔丁基对甲酣z化学纯。4.9 1%磷酸溶被(体积分数):量取10mL磷酸
4、(4.3)和990mL水，混匀后备用。4.10 二氯甲烧-甲醇溶液z量取250mL二氯甲烧和750mL甲酶，加入0.5g 2，6-二叔丁基对甲酣(4.的，混匀后备用。4.11 0.1 mol/L氢氧化铀-甲蹲榕液z称取0.4g氢氧化铀(4.4)，用甲醇溶解并稀释至100mL，混匀后备用。4.12 2%磷酸-甲醇椿液体积分数):量取2mL磷酸(4.3)和98mL甲醇，混匀后备用。4.13 全反式虾青素、13-顺虾青素、9-顺虾青素标准品z纯度二三95%。4.14 全反式虾青素标准储备溶液z准确称取全反式虾青素标准品约10mg，用丙酣溶解并定容于500 mL容量瓶中，此溶液浓度为20g/mL，充氨
5、密封，置-18c冰箱中避光保存，有效期1个月。1 GB/T 31520-2015 4.15 13-顺虾青素标准储备溶液z准确称取13-顺虾青素标准品约1mg.用丙圃需解并定容于50mL 容量瓶中，此溶液浓度为20g/mL.充氮密封，置一18c冰箱中避光保存，有效期1个月。4.16 9-顺虾青素标准储备需液z准确称取9-顺虾青素标准品约1mg.用丙圃溶解并定容于50mL容量瓶中，此需液浓度为20g/mL.充氮密封，置-18c冰箱中避光保存，有效期1个月。4.17 全反式虾青素标准工作溶液=准确移取适量全反式虾青素标准储备溶液(4.14)用丙酣稀释成浓度分别为0.1g/mL、0.5g/mL、1.0
6、g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL、10.0g/mL的标准工作液，现配现用。4.18 13-顺虾青素标准工作榕液z准确移取13-顺虾青素标准储备禧液(4.1日，用丙圃配制成适当浓度的标准工作攘，用于定性，现配现用。4.19 9-顺虾青素标准工作溶液z准确移取9-顺虾青素标准储备禧液(4.16).用丙圃配制成适当浓度的标准工作液，用于定性，现配现用。5 仪器5.1 高效液相色谱仪z配紫外检测器。5.2 分析天平z感量。.00001g、0.0001 g各一台。5.3 超声波清洗机5.4 冷冻离心机:8000r/mino 5.5 旋涡混合器。5.6 氮吹仪。5.7 具塞聚丙烯离心管:50mL。
7、5.8 棕色容量瓶:50 mLo 5.9 棕色比色管:10mLo 5.10 玻璃匀浆器110mLo 6 测应步骤6.1 提取准确称取雨生红球藻粉50mg-100 mg(精确到0.1mg).置于干燥的玻璃匀浆器中，加入1mL二氯甲烧-甲醇溶液(4.10)充分研磨使细胞壁破碎完全，转移至50mL离心管中，用10mL二氯甲烧-甲障榕液(4.10)分3次清洗玻璃匀浆器，合并提取液。超声提取5min.5 c下8000 r/min离心5min.将上清液转移至50mL容量瓶中，离心管中再加入10mL二氯甲烧-甲蹲榕液(4.10).重复上述步骤3次以上，直到提取后的藻渣为白色，合井上清液，用二氯甲烧-甲蹲溶液
8、(4.10)定容至50mL.然后静置15 min。准确移取5mL上清被于另一50mL容量瓶中，用二氯甲烧-甲酶禧液(4.10)稀释并定容，备用。注z虾青索含量高于2%的雨生红球藻粉的称祥量不大于50mg o 6.2 皂化从上述容量瓶中准确移取5mL溶液于10mL比色管中，加入0.7mL氢氧化铀-甲蹲溶液(4.11) 涡旋混合，充氮密封，在5C冰箱中反应过夜12h-14 h。然后在反应液中加入0.4mL 2%磷酸-甲醇溶液(4.12)中和剩余的碱，混匀，在氯气吹扫下定容至5mL.过0.45m滤膜，滤液作为试样溶液。注2若试样溶液的色谱圈中，在20min-30 min的出峰处存在杂峰，将加碱量提高
9、一倍后重新取提取液皂化。2 GB/T 31520-2015 6.3 副定6.3.1 色谱条件6.3. 1. 1 色谱柱:C30色谱柱，250mmX4.6 mm，5m，或相当者。6.3.1.2柱温:25 c。6.3.1.3 检测器E检测波长为474nm. 6.3.1 .4 进样量:20L。6.3.1.5 流速:1.0mL/min. 6.3.1.6 流动相z梯度洗脱程序见表1.表1流动相梯度洗脱程序时间/minA/% B/% 。81 15 15 66 30 23 16 80 27 16 80 30 81 15 35 81 15 注:A为甲自事，B为叔丁基甲基酶，C为1%磷酸溶液，6.3.2 定性方
10、法C/% 4 4 4 4 4 4 分别注人20L适当被度的全反式虾青素标准工作液(4.17)、13-顺虾青素标准工作液(4.18)、9-顺虾青素标准工作液(4.19)及试样溶液(6.2)，按6.3.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定，根据标准工作液色谱图中三种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。标准品色谱图参见附录A 6.3.3 定量方法根据试样溶液中虾青素的含量情况，选定峰面职相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多点校准定量，试样测定结果以三种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。7 结果计算试样中虾青素的含量cX)以质量分数计
11、c%)，按式(1)计算，保留3位有效数字。式中z(1.3 XA13-ci, +A阳刚十1.1XA由)X C. X V X 10-3 X=. f 100% Xm X 一一样品中虾青素的含量，%;.c 1 ) 3 GB/T 31520-2015 1. 3 -13-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子5A 13-ris一一试样溶液中13-顺虾青素的峰面积gA_一一试样溶液中全反式虾青素的峰面积F1.1 一-9-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子zA9-ci，二一一试样溶液中9-顺虾青素的峰面积FC. 一一标准工作液中全反式虾青素的含量，单位为微克每毫升(g/mL); V 二一试样溶液体积，单位为毫升(mL
12、);A. 全反式虾青素标准工作液的峰面积zm 一一样品质量，单位为毫克(mg); f 一一稀释倍数，为100.8 方法的灵敏度、准确度和精密度8.1 灵敏度本方法的定量限为500mg/kg. 8.2 准确度雨生红球藻中全反式虾青素添加浓度为500mg/kg2 000 mg/kg时，回收率为90%110%。8.3 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。4 GB/T 31520-2015 附最资料性附录)色谱圄A 虾青章同分异构体标准溶液色谱圈60 mAU 80 40 20 。A. 1 -20 25 20 虾青素同分异构体标准溶遣色谱圄(5.0mg/L)
13、15 10 5 图A.1 。雨生红球藻试样溶液色谱圄A.2 mA 凹咀时.口时50 40 30 20 10 25 20 雨生虹球藻试样溶攘的色谱圄15 10 圄A.25 5 mFONlONmFmH旨。国华人民共和国家标准红球藻中虾青蠢的测定擅相色谱法GB/T 31520-2015 中-铃中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总结室，(010)68533533发行中心，(010)51780238读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销铃印张0.75字数10千字2015年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2015年5月第一版* 书号，155066. 1-49706 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 31520-2015 打印日期:2015年6月9HF002
