1、中华人民共和国国家标准食品中黄曲霉毒素B1、矶、G1、G2的测定方法Method for determination of aflatoxins 8 , , B2 ,G, ,G2 in foods 1 主题内容与适用范围本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素矶、B2、G，、G，的测定方法。本标准适用于各种食品中黄曲霉毒素Bl.B2.GJ、G2的测定。GB/T 5009.23-1996 代替GB5009.23 85 在薄层板上的最低检出量:黄曲霉毒素B，G，为0.004g.也、G2为0.002g。本方法的最低检出浓度黄曲霉毒素B，、G，为5g/kg.B，、G2为2.5g/kg。2 引用标准6日/T50
2、09.22 食品中黄曲霉毒素矶的测定方法第一篇薄层色谱法3 原理样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365nm紫外光下，黄曲霉毒素BB2产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、G2产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。4试M4. 1 所用试剂同GB/T5009.22中3.1 3. 130 4.2 次氯酸纳溶液(消毒用)，配制方法见GB/T5009. 22中3.16。4.3 苯乙醇水(46+35+19)展开剂:取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5min，静置过伐。将1: F层溶液分别置于具寨瓶中保存，上下层交界的溶液弃去不要。若溶液出现混浊，则在80C水浴上加热，待清晰后，即停止
3、加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量的下层溶液置小皿中，再放于展开槽内。将薄层板放入展开槽内，预先饱和10min后展开。4.4 硫酸。+3)。4. 5 黄曲霉毒素B，、B2.G1、G2标准溶液。4. 5. 1 单一标准溶液(OE/mLh准确称取黄曲霉毒素B，、G，标准品各11.2 mg.黄曲霉毒素矶、G2标准品各O.50. 6 mg.用苯乙腾混合液作溶剂。配制方法、浓度及纯度的测定参照GB/T5009. 22 中3.140 黄曲霉毒素矶、B2、G，、马的分子量及用苯-乙腊作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数F炭。中华人民共和国卫生部1996-06-19批准1996-09-01实施j76
4、GB/T 5009.23-1996 的1111际1年军何时:最大吸收峰波长，nm摩尔消光桌数分子量B, 316 19800 312 B 348 20 900 314 353 17 100 328 354 18200 330 4. 5. 2 侨和豆叶i使用液以F各标准!x均用苯乙脯混合液配制。4.5.2.1 !iltlJ霉毒素混合标准使用液1，每毫升相当于O.2g黄曲霉毒素B，、Et11生O.1吨黄曲霉毒夹在1、(;口neli;位用。4. 5. 2. 2 黄山霉毒素混合标准使用液n，每毫升相当于0.04吨黄曲霉毒素B，、G，及O.02g黄曲霉，!j东B.、(主，.作最低检出量刑。5 仪器liJ
5、(;l,T 5009.22中4.14.9。6 分析步骤6. 1 怦:同GB/T5009.22中5.1. 6 2 悦耳1.1口1GB/T 5009. 22中5.2。6. 3 ll!IJ ;t , 6. 3. 1 时10)展开法6. 3.1 .1 薄层板的制备同GB/T5009. 22中5.3.1.1.6.3.1.2 点佯，1司GB/T5009.22中5.3. 1. 20滴加式祥如下百3公.IOL黄曲霉毒素混合标准使用液E。?书Aj120L样液。句飞二点20L样液+10L黄曲霉毒素混合标准使用液I0 纳闷点，20L悴液+10L黄曲霉毒素混合标准使用液I。6 3.1.3 展开与观察.黄曲霉毒素矶、B
6、2、G，、G2的比移值依次排列为B，B2G，G20(1: II Jf懵内加10mL无水乙酶，预展12cm，取出挥干，再于另一展开槽内加10mL丙酬三氯甲烧刊十92)，展汗1012cm，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。6. 3. 1. 3. 1 由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液I或I，可使黄曲霉毒素B，、BZG1、马分别与怦液中的黄曲霉毒素B，、B2、G，、G，荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素矶、B、川、G依次为O.000 4 , O. 000 2 , O. 000 4 , O. 000 2阅，可用作检查在样液内黄曲霉毒素BlBzG、马ilVj此低怆出址是否正
7、常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B，、民、G，、Gh ;(斗Il.002.0. 001，0.002，0.001降，主要起定位作用。6. 3. 1.3.2 若第二点在与黄曲霉毒素B，、鸟的相应位置上无蓝紫色荧光点，或在与黄曲霉毒素矶、G2的fIIl，l位拌上元黄绿色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素矶、G，含量在5g/kg以下;B2. G2含量在二)t哨!kgf:.(f;在日在相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。631.4 确1E试验:6. 3. 1.4. 1 黄曲霉毒素与三氟乙酸反应产生衍生物，只限于B，和G1;E2和G2与三氟乙酸不起反应。11 , fl1州的衍牛
8、物比移值为B，G，0于薄层极左边依次滴加两个点吁:点，0L黄曲霉毒素混合标准使用液E。沾点:20l.样液。r以t网点各加兰氟乙酸1小滴盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层I) L!fJ洲度不高于40C。再于薄层板上滴加以下两个点。577 G/T 5009.23 1996 :有一点0L黄曲霉毒素混合标准使用液E。第四点，20L样液。冉展厅(同6.3.1.3)，在紫外光灯下观察样液是沓产生与黄曲霉毒素B，或G，标准点相同的衍生物，未加l二抵乙峻的气、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空臼对照。6.3.1.4.2 黄曲霉毒素民和马的确证试验，可用苯一乙醇-水(46十35
9、十19)展开，若标准点与样液点出现是叠，ft 1口J确定。6.3. 1.4.3 在展开的薄层板上喷以硫酸。十3)，黄曲霉毒素矶、B2、G，、G，都变为黄色荧光。6. 3. 1. 5 稀释定结z样液中黄曲霉毒素B，、民、G，、乌荧光点的荧光强度如各与黄曲霉毒素B，、B，、(川、G2标准点的最低检出量(矶、G，为O.000 4g，BhG2为O.000 2g)的荧光强度一致，则样品中黄山霉毒素矶、G，含J-J;为5吨/kg;B，.G2含量为2.5g/怡。如祥液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检lli垃强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计)1j法参
10、照GB/T5009.22中5.3.1.5与5.3.1.606. 3. 2 双向展开法6. 3. 2. 1 滴加两点法6. 3. 2.1.1 点样:取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲莓毒素标准使用液与样液。ap在二块板的NI:i左边缘。.81 cm处各滴加10L黄曲霉毒素混合标准使用液n.在距左边缘2.83.0cm处各滴加20L样液.然后在第二板的样液点上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液E;在第三板上的样液点上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液I。6. 3. 2. 1. 2 展开:同GB/T5009.22中5.3.2.1.206.3.2.1.3 观察及评定结果:6.3.2.1.3.1
11、在紫外光灯下观察第、工板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素矶、B2、G，、G2标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，贝IJ样品中黄曲霉毒素B，、心1含量在5问/kg以下;B2、G2的含量在2.5g/kg以下。6. 3. 2.1. 3. 2 若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第王板比较，看第三板上第-点与第板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素B，、也;GJ G2标准点重季，如果最碍，再按6.3.2.1.3.3进行所需的确证试验。6. 3. 2. 1. 3. 3 黄曲霉毒素矶、G，的确证试验:取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘O
12、.81 cm处得滴加10I，L黄曲霉毒素混合标准使用液E及1滴三氟乙酸，距左边缘2.83 cm处，第9板滴加20 I，L样液及1滴兰氟乙酸，第五板滴加20L样液、10L黄曲霉毒素混合标准使用液E及l滴三纸乙暇。产生衍生物的步骤及展开方法同GB/T5009. 22中5.3.2.1.观察祥液点是否各产生与其黄曲霉毒素队或G，标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B1.B2.G1.G2含量高时，则将样液稀释后按6.3.1.4作确证试验。稀择定量与计算参照GB/T5009.22中5.3. 2. 1. 5与5.3. 2. 1. 6。6.3.2.2 滴加一点法同GB
13、/T5009.22中5.3.2.2。所不同处是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素混合标准使用液H代悻黄曲霉毒素B，标准使用液(0.04g/mLl。稀释定量与计算参照GB/T5009. 22中5.3.2.2与5.3. 1. 60 第二篇微柱筛选法7 原理佯品提取液通过由氧化铝与硅续吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉丑j素被砖钱l吸附剂I吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含回成jFS78 GB/T 5009.23-1996 比.由于微性不能分离B，、B2、G，、G2，故结果为黄曲霉毒素的总量。8试J8. 1 石油醒:沸程6090C或3060C。
14、8. 2 巾性氧化铝.层析用100200日。8. 3 酸性氧化铝z层析用100200日。8.4 元水硫酸纳:过4080目筛或80100目筛。8. 5 硅续型吸附剂z层析用100200日。8.6 甲醇水溶液，(55+45)。8. 7 展开剂2丙嗣三氯甲烧0+9)。8.8 脱脂棉z用索氏提取器以二氯甲烧为溶剂提取2h.挥干后贮于瓶中保存。8. 9 黄曲霉毒素B，标准液=用苯-乙腊(98+2)配成O.4g/mL的贮存液及O.1g/mL的使用液，避光冷战。注层析用氧化铝、硅镶型吸附剂、无水硫酸销应在120C活化拙，密塞，贮于干燥器内可保存周。9 仪器9. 1 紫外光灯，8100W.带有波长365nm滤
15、光片。9.2 微柱管2内径。.4cm，长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗管。9.3 微柱管架。9. 4 微量注射器，50mLo 10 分析步骤10. 1 提取10. 1. 1 粮食、花生及其制品z取粉碎过筛(20目)样品20.00日于具塞锥形瓶中，加100mL甲醇水溶液.30mL石油酶，密塞振摇30min，静置片刻，过滤于50mL具塞量筒中，收集50mL甲醇水滤液(注意切勿将石油酷层带入滤液中).转入分液漏斗中，加50mL硫酸纳溶液(20g/U稀释，加三氯甲:皖J () rnL，轻摇2，._3min，静置分层，兰氯甲烧层通过装有5g无水硫酸纳的小漏斗脱水(以少量脱脂棉球塞i:漏斗颈口，并
16、以少量三氯甲炕润湿).并源10mL比色管中，再向分液漏斗中加3mL三氯甲烧重捷次.脱水后滤入原比色管中，以少量三氯甲烧洗漏斗并定容至10.0mL.混匀，密塞，待测。此样液1 mL相当1.0 g样品。10. 1. 2 植物汹称混匀油样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油酷分数次洗入分液漏斗中，加50 mL甲醇水溶液轻摇2-3min，静置分层，将下层甲醇水溶液转入另一分液漏斗中，加50mL硫酸纳水阳在(20g/U稀释，加三氯甲烧10mL.以下按10.1.1自轻摇2-3min起操作。此样液1mL相当.Og样品。10. 1. 3 发酵酒、酱油、醋等水溶性样品:啤酒等含CO2的样品，需在烧杯中
17、于水浴上加热、搅拌、除去气泡.否则易乳化。称i昆匀样品20.00 g于小烧杯中，以80mL硫酸销溶液(20g/L)洗入分液漏斗中，加斗(1j1炕10mL，此样液1mL相当2.0g样品。10. 1. 4 腐乳、黄酱类:称取混匀样品20.00 g于具塞锥形瓶中，加甲醇水溶液100mL.石油酷20mL。振荡30rnin.静Ft片刻，以折叠快速定性滤纸过滤于50mL具塞量筒中，收集甲醇水滤液50时，(相当1 n g怦;同.冈为10g样品中约含有5mL水).置于分液漏斗中，加入兰氯甲:烧10mL.以下按10.1. 1白付出:3m1n起操作。此样液1mL相当1.0 g样品。102IW定10.2.1 微柱智
18、的制备以少量脱脂棉做底用粗铁丝砸实，置于微柱管架上，依次加入高为0.5cm无水579 GB/T 5009.23-1996 硫酸纳(80100目)，0.5cm硅缕型吸附剂，0.5 cm无水硫酸纳(80100日) 1. 5 cm中性氧化铝，1. 5 cm酸性氧化铝，3cm无水硫酸饷(4080目).顶部以少量脱脂棉堵塞，装试剂时管要垂直，每装一种试剂要适当敲紧，两种试剂之间界面要平齐，柱管要随装随用，以免在空气中吸水活性下降。10. 2. 2 微柱层析g在装好的微柱中，加入兰氯甲:皖提取液1.OmL.同时做标准管，另取三支微柱管，各加入二氯甲炕1mL，再分别加入黄曲霉毒素BI标准液(0.1吨/mL)
19、O.50.100L.相当黄曲霉毒素BI标准。，5，10ng，待加液流至顶层时，即加入1mL丙嗣-三氯甲烧。十9)展开剂，在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果。10.2.3 结果观察与评定:于波长365nm紫外光灯下观察，将层析后的祥品管依次与0，5，10ng黄曲霉毒素队标准管比较，若样品柱管内硅续型吸附剂层与0管一致则为阴性(在5问/kg以下).如样品管中硅续吸附剂层呈蓝紫色荧光环，则为阳性，并需进一步按薄层层析法进行确证测定，但不需重新提取样品。其操作如下准确吸取原三氯甲烧提取液4.0mL(相当4g或8g样品)于小蒸发皿内挥干，以少量苯-乙睛混合液(98+2)分数次转入刻度小管中，定容至1.0 mL.密寒，混匀，按薄层层析法确证，并测定黄曲霉毒素BI、B，、G1、G2的含量。附加说明.本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准第一篇由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草;第三篇由北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准由E生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。580
