1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 5009. 24-2003 代替GB/T5009. 24一1996食品中黄曲霉毒素M，与B，的测定Determination of aflatoxins M1 and B1 in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员瓦G/T 5009.24-2003 198 前言本标准代替GB/T5009.24-1996(食品中黄曲霉毒素M1与Bl的测定方法。本标准与GB/T5009.24二1996相比主要修改如下2修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中黄曲霉毒素M1与队
2、的测定h按照GB/T20001. 4-2001(标准编写规则第4部分:化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准于1985年首次发布，于1996年第一次修订，本次为第二次修订。GBfT 5009.24-2003 食品中黄曲霉毒素M，与B，的测定1 范围本标准规定了牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M】与队的测定方法。本标准适用于牛乳及其制品、黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中黄曲霉毒素M，与队的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成
3、为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 5009. 22-2003 食品中黄曲霉毒素队的测定3 原理试样经提取、浓缩、薄层分离后，黄曲霉毒素M，与B，在紫外光(波长365nm)下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。4 试剂4.1 同GBjT5009. 22-2003中第3章。4.2 异丙醇。4.3 硅胶G，层析用。4.4 氯化铺及氯化锅溶液(40g/L)。4.5硫酸0+3)。4.6
4、玻璃砂z用酸处理后洗净、于燥，约相当于20目。4.7 黄曲霉毒素M，标准溶液z用三氯甲烧配制成每毫升相当于10用的黄曲霉毒素M，标准溶液。以三氯甲统作空白试剂，黄曲霉毒素M，的紫外最大吸收峰的波长应接近357nm ，摩尔消光系数为19 9500避光，置于40C冰箱中保存。4.8 黄曲霉毒素M1与B1混合标准使用液z用三氯甲统配制成每毫升相当于各含0.04闭的黄曲霉毒素M1与B，o避光，置于4C冰箱中保存。5 仪器同GBjT5009. 22-2003中第4章。6 分析步骤整个操作需在暗室条件下进行。6.1 试样提取6. 1. 1 试样提取和j备表，见表10199 GB/T 5009.24-200
5、3 表1试样制备称样量/加7量/加甲醇量/提取液量/加40g/L氯化试样名称铀溶液量/g mL mL mL mL 牛乳30 。90 62 25 炼乳30 。90 52 35 牛乳粉15 20 90 59 28 乳酷15 5 90 56 31 黄油10 45 55 80 。猪肝30 。90 59 28 猪肾30 。90 61 26 猪瘦肉30 。90 58 29 猪血30 。90 61 26 6. 1. 2 提取液量按式(1)进行计算。式中gx=立X(90+A+ B) 15 X一一提取液量，单位为毫升(mL)，浓缩体积/滴加体积/方法灵敏度/mL L g/kg 0.4 100 0.1 0.4 5
6、0 0.2 0.4 40 0.5 0.4 40 0.5 0.4 40 0.5 0.4 50 0.2 0.4 50 0.2 0.4 50 0.2 0.4 50 0.2 (1 ) A 试样中的水分量，单位为毫升(mL)(牛乳、炼乳及猪组织的取样量为30g.牛乳粉、乳酸的取样量为15g) , B一一加水量，单位为毫升(mL)。注，试样中的水分量参照中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所编著的食物成分表队因各提取液中含48mL甲醇，需39mL水才能调到甲醇与水之体积比为(55+4日，因此加人氯化纳溶液(40g/L)量等于(87mL)减去提取液量(mL)。6. 1. 3 牛乳与炼乳z称取30.00g混匀
7、的试样，置于小烧杯中，再分别用90mL甲醇移于300mL具塞锥形瓶中，盖严防漏。振荡30min，用折叠式快速滤纸滤于100mL具塞量筒中。按表1收集62mL牛乳与52mL炼乳(各相当于16g试样)提取液。6. 1. 4 牛乳粉z取15.00g试样，置于具塞锥形瓶中，加入20mL水，使试样湿润后再加入90mL甲醇，以下按6.1.3自振荡30min.起依法操作，按表1收集59mL提取液(相当于8g试样)。6. 1. 5 乳酶2称取15.00g切细、过10目圆孔筛的混匀试样，置于具塞锥形瓶中，加5mL水和90mL 甲醇，以下按6.1.3自振荡30min.起依法操作，按表1收集56mL提取液(相当于8
8、g试样)。6. 1. 6 黄油g称取10.00g试样，置于小烧杯中，用40mL石油酷将黄油溶解并移于具塞锥形瓶中。加45 mL水和55mL甲醇，振荡30min后，将全部液体移于分液漏斗中。再加入1.5日氯化纳摇动溶解，待分层后，按表1收集80mL提取液(相当于8g试样)于具塞量筒中。6. 1. 7 新鲜猪组织z取新鲜或冷冻保存的猪组织试样(包括肝、肾、血、瘦肉).先切细，混匀后称取30.00 g.置于小乳钵中，加玻璃砂少许磨细，新鲜全血用打碎机打匀，或用玻璃珠振摇抗凝。混匀后称取30.00g.将各试样置于300mL具塞锥形瓶中，加入90mL甲醇，以下按6.1. 3自振荡30min. 起依法操作
9、。按表1收集59mL猪肝.61mL猪肾.58mL猪瘦肉及61mL猪血等提取液(各相当于16 g试样)。6.2 净化6.2.1 用石油隧分配净化s将以上收集的提取液移入250mL分液漏斗中，再按各种食品加入一定体积的氯化纳溶液(40g/L)(见表1)。再加入40mL石油隧，振摇2min，待分层后，将下层甲醇氯化销200 GB/T 5009.24-2003 水层移于原量筒中，将上层石油隧溶液从分液漏斗上口倒出，弃去。再将量筒中溶液转移于原分液漏斗中。再重复用石油隧提取两次，每次30mL，最后将量筒中溶液仍移于分液漏斗中。黄油样液总共用石油酷提取两次，每次40mL. 6.2.2 用三氯甲统分配提取=
10、于原量筒中加入20mL三氯甲妓，摇匀后，再倒入原分液漏斗中，振摇2 mino待分层后，将下层三氯甲烧移于原量筒中，再重复用三氯甲烧提取两次，每次10mL合并于原量筒中。弃去上层甲醇水溶液。6.2.3 用水洗三氯甲烧层与浓缩制备z将合并后的三氯甲烧层倒回原分液漏斗中，加入30mL氯化销溶液(40g/L) ，振摇30s，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层三氯甲烧层收集于原量筒中。加入10g元水硫酸钩，振摇放置澄清后，将此液经装有少许无水硫酸纳的定量慢速滤纸过滤于100 mL蒸发皿中。氯化销水层用10mL三氯甲烧提取一次，并经过滤器一并滤于蒸发皿中。最后将无水硫酸销也一起倒于滤纸上，用少量三
11、氯甲烧洗量筒与无水硫酸锅，也一并滤于蒸发皿中，于65C水浴上通风挥干，用三氯甲统将蒸发皿中残留物转移于浓缩管中，蒸发皿中残渣太多，则经滤纸滤入浓缩管中。于65C用减压吹气法将此液浓缩至0.4mL以下，再用少量三氯甲烧洗管壁后，浓缩定量至0.4 mL备用。6.3 测定6.3.1 硅胶G薄层板的制备薄层板厚度为0.3mm，105C活化2h，在干燥器内可保存1d2 d. 6.3.2 点板取5cmX20 cm的薄层板两块，距板下端3cm的基线上各滴加两点，在距第一与第二板的左边缘。8cml cm处各滴加10L黄曲霉毒素M，与B，混合标准使用液，在距各板左边缘2.8 cm3 cm处各滴加同-样液点(各种
12、食品的滴加体积见表1)，在第二板的第二点上再滴加10L黄曲霉毒素M，与B，混合标准使用液。一般可将薄层板放在盛有干燥硅胶的层析槽内进行滴加，边加边用冷风机冷风吹干。6.3.3 展开6.3.3.1 横展2在槽内加入15mL事先用无水硫酸纳脱水的无水乙醋(500mL元水乙隧中加20g元水硫酸纳)。将薄层板靠近标准点的长边置于槽内，展至板端后，取出挥干，再向上继续展开一次。6.3.3.2 纵展=将横展两次挥干后的薄层板再用异丙醇丙酣苯正己烧石油酷(沸程60C90C)-三氯甲烧(5+10+10+10十10+55)混合展开剂纵展至前沿距原点距离为10cm12 cm取出挥干。6.3.3.3 横展z将纵展挥
13、干后的板再用乙隧横展1次2次，展开方法同6.3.3.1.6.3.4 观察与评定结果6.3.4.1 在紫外光灯下将第一、二板相互比较观察，若第二板的第二点在黄曲霉毒素M，与B，标准点的相应处出现最低检出量(M，与队的比移值依次为0.25和0.43)，而在第一板相同位置上未出现荧光点，则试样中黄曲霉毒素M，与B，含量在其所定的方法灵敏度以下(见表1)。6.3.4.2 如果第一板的相同位置上出现黄曲霉毒素M，与队的荧光点，则第二板第二点的样液点是否各与滴加的标准点重叠，如果重叠，再进行以下的定量与确证试验。6.3.5 稀释定量样液中的黄曲霉毒素M，与B，荧光点的荧光强度与黄曲霉毒素M，与B，的最低检
14、出量(0.000 4g)的荧光强度一致，则牛乳、炼乳、牛乳粉、乳酸与黄油试样中黄曲霉毒素M，与B，的含量依次为O.1、0.2、0.5、0.5及0.5问/kg;新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉试样均为0.2月/kg(见表1)。如样液中黄曲霉毒素M，与B，的荧光强度比最低检出量强，则根据其强度逐一进行测定，估计减少滴加微升数或经稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。6.3.6 确证试验在做完定性或定量的薄层板上，将要确证的黄曲霉毒素M，与队的点用大头针圈出。喷以硫酸溶GB/T 5009.24-2003 液。+3)，放置5min后，在紫外光灯下观察，若样液中黄曲霉毒素M，与B，点同标准点一样均变为黄色荧光，则进一步确证检出的荧光点是黄曲霉毒素M，与，。6.3.7 结果计算黄曲霉霉素M，或队的含量按式(2)进行计算;V, 1000 X = 0.000 4 X云CXDXV2 1n 式中=X一一黄曲霉毒素M，或B，含量，单位为微克每千克仰自/kg); V , 样液浓缩后体积，单位为毫升(mL);V，一一出现最低荧光样液的滴加体积，单位为毫升(mL);D一一浓缩样液的总稀释倍数;m一一一浓缩样液中所相当的试样质量，单位为克(g); 0.0004-一一黄曲霉毒素M，或B，的最低检出量，单位为微克(g) 结果表示到测定值的整数位。202 .( 2 )
