1、中华人民共和国国家标准食品中合成着色剂的测定方法Method for determination of synthetic colour in foods 1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中合成着包剂的测定方法，本标准适用于食品中合成着色剂的测定。第-篇高效液相色谱法(第一法)2 原理GB/T 5009.35-1996 代替GB5009. 35-85 食品中人工合成着色剂用聚酷胶吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。最小检出量，新红5ng、拧橡黄4ng、克莱红6ng、脑脂红8ng、日落黄7ng、赤葬红18ng、亮
2、蓝26吨，当进祥量相当0.025g时最低检出浓度分别为0.2mg/kg , 0.16 mg/kg , O. 24 mg/kg , O. 32 mg/kg , O. 28 mg/kg , O. 72 mg/kg ,1. 04 mg/kgo 3试!ll13.1 正己烧。3. 2 盐酸。3. 3 乙酸。3.4 甲醇.经滤膜(0.5m)过滤.3.5 聚酿胶粉(尼龙6)，过200目筛。3. 6 乙酸锁溶液(0.02mol/L) ，称取1.54 g乙酸馁，加水至1000mL.溶解，经滤膜(0.45m)过滤。3. 7 氨水:量取氨水2mL.加水至100mL.混匀.3.8氨水乙酸镀溶液(0.02mol/L)
3、，量取氨水0.5mL.加乙酸镀溶液(0.02 mol/L)至10mL.混匀。3.9 甲醇-甲酸(6+4)溶液E量取甲醇60mL.甲酸40mL.混匀.3.10 拧稼酸溶液g称取20g拧糠酸(C.H.O， H，O).加水至100mL.溶解混匀。3.11 元水乙醇-氨水-水(7+2+1)溶液=量取无水乙醇70mL、氨水20mL、水10mL.l!匀。3.12 三正辛胶正了醇溶液(5%):量取三正辛胶5.mL.加正丁醇至100mL.混匀。3. 13 饱和硫酸销溶液.3.14 硫酸销溶液(2g/L)。3.15 pH6的水s水加拧糠酸溶液谓pH值到603. 16 合成着色剂标准溶液g准确称取按其纯度折算为1
4、00%质量的拧糠黄、日落黄、克莱红、脑脂红、新红、赤辞红、亮蓝、自在蓝各0.100g.置100mL容量瓶中，加pH6水J11刻度。配成水溶液(1.00mg/ mL)。中华人民共和国卫生部1996-06-19批准1996-09-01实施36 GB/T 5009.35-1996 3.17 合成着色剂标准使用液:临用时上述溶液(或将3.16)加水稀释20倍，经滤膜(0.45m)过滤。配成每毫升相当50.0月的合成着色剂。4 仪器高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。5 分析步骤5. 1 样品处理5. 1. 1 桔子汁、果味水、果子露汽水等z称取20.040. 0 g，放入100mL烧杯中。含
5、二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。5. 1. 2 配制酒类s称取20.040. 0 g，放100.mL烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。5. 1. 3 硬糖、蜜钱类、淀粉软糖等s称取5，0010.00 g，粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30 mL，温热溶解，若样品溶液pH值较高，用拧橡酸溶液调pH值到6左右。5. 1.4 巧克力豆及着包糖衣制品z称取5.OO 10. OOg，放入.100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液.5. 2 色素提取5. 2. 1 聚眈胶吸附法:样品溶液加拧橡酸溶液调pH值到6，加热至60C，将1g聚眈胶粉加少许水调成
6、粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60CpH=4的水洗涤35次，然后用甲醇甲酸混合溶液洗涤35次(含赤辞红的样品用5.2. 2法处理)，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸35次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，燕发至近于，加水溶解，定容至5mL。经滤膜(0.45m)过滤，取10L进高效液相色谱仪。5.2.2 液-液分配法(适用于含赤薛红的样品):将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胶正丁醇溶液(5%)1020mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，至到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸纳溶液洗2次，每次10mL.分取有机相i放蒸发皿中，水浴加热
7、浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60nL正己烧，混匀，加氨水提取23次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烧洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经滤膜(0.45m)过滤，取10L进高效液相色谱仪。5.3 高效液相色谱参考条件5. 3. 1 柱:YWG-C18 10m不锈钢柱4.6mm(id) X 250 mm。5.3.2 流动相z甲醇-0.02mol/L乙酸镀溶液(pH=4)。5. 3. 3 梯度洗脱g甲醇:20%35%,3%/min, 35% 98%， 9 %/min, 98.%继续6min 5. 3. 4 流速:1mL/min 5.3
8、.5 紫外检测器，254nm波长。5.4 测定取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。5.5 计算X=AI X 1 000 I - m1 X V ,;V1 X 1 000 X 1 000 . ( 1 ) 式中;X 样品中着色剂的含量，g/kg，ml 样液中着色剂的质量，g，V2 进中芋体积，mL;V1 样品稀释总体积，mL;37 GB/T 5009.35-1996 m , 样品质量.g。结果的表述:报告算术平均值的二位有效数。5.6 允许差相对相差10%。5. 7其他z 6 8 3 5 4 J.种着色弗j色谱分离图1一新红，2一样橡黄，3
9、克莱红，4-t!蓝，5腼脂红g6 日落黄，7一亮蓝，8一赤鲜红第二篇薄层色谱法(第二法6 原理水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚自由黯吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量.最低检出量为50阅，点样量为1I!.样品最低检出浓度约为50 mg/kg。7 试剂7. 1 石油隧z沸程60900C。7.2 甲醇。7.3 聚航胶粉尼龙6)zzqo目.7.4 硅胶G.7.5 硫酸，(1+10)。7.6 甲醇甲酸溶液，(6+心。7.7 氢氧化销溶液(508AL) 7.8 海沙z先用盐酸(1+ 10)煮沸15mn，用水洗至中性，再用氢氧化销溶液(50g/L)煮沸
10、15min，用水洗至中性，再于105C干燥，贮于具玻璃寨的瓶中，备用.7.9 乙醇(50%)。7.10 乙醇氨溶液:取1mL氨水，如乙醇(70%)至100mL. 7.11 pH6的水:用拧橡酸溶液(20%)调节至pH6。7.12 盐酸。+10).7. 13 拧橡酸溶液(200g/U。7.14 伺酸纳溶液(100g/L)。38 7.15 碎瓷片z处理方法同7.8。7.16 展开剂GB/T 5009. 35一19967.16.1 正丁醇-无水乙醇-氨水0%)(6+2+3)，供纸色谱用。7.16.2 正了醇口比呢氨水(1%)(6+3+4)，供纸色谱用。7.16.3 甲乙阔丙酣水(7+3+3)，供纸色
11、谱用。7.16.4 甲醇-乙二胶-氨水(10+3+2)，供薄层色i昔用。7.16.5 甲醇氨水乙醇(5+1十10)，供薄层色谱用。7.16.6 拧橡酸纳溶液(25g/L)-氨水乙醇(8+1+2)，供薄层色谱用。7.17 合成着色剂标准溶液.按3.16方法，分别配制着色剂的标准溶液浓度为每毫升相当于1.0mgo7.18 着色剂标准使用液，I脑用时吸取色素标准溶液各5.0mL.分别置于50mL容量瓶中，加pH6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于O.10 mg着色剂。8仪器8. 1 可见分光光度计。8.2 微量注射器或血色素吸管。8.3 展开槽.25cmX6 cmX4 cmo 8.4 层析缸。8.5
12、 滤纸:中速滤纸，纸色谱用。8.6 薄层板5cmX 20 cmo 8.7 电吹风机。8.8 水泵。9 分析步骤9. 1 样晶处理9. 1. 1 果味水、果子露、汽水.称取50.0g样品于100mL烧杯中。汽水需加热驱除二氧化碳。9. 1- 2 配制酒称取100.0 g样品于100mL烧杯中，加碎瓷片数块.加热驱除乙醇。9.1.3 硬糖、蜜饿类、淀粉软糖:称取5.00或10.0g粉碎的样品，加30mL水，温热溶解，若样液pH值较高，用拧橡酸溶液.(200g/L)调至pH4左右。9. 1.4. 1 奶糖2称取10.0g粉碎均匀的样品，加30mL乙醇氨溶液溶解，置水浴上浓缩至约20mL , 立即用硫
13、酸溶液。+10)调至微酸性再加1.0 mL硫酸(1个10).加1mL鸽酸饷溶液(100g/L).使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。9. 1.4. 2 蛋糕类z称取1O.Og粉碎均匀的样品，加海沙少许，混匀，用热风吹干用品用手摸已干燥即可以).加入30mL石油田撞搅拌。放置片刻，倾出石油醋，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部倒入G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下按9.1.4.1自置水浴上浓缩至约20mL起依法操作。9.2 吸附分离将处理后所得的溶液加热至70C.加入0.51.0g聚酷胶粉充分搅拌，用拧橡酸溶液(200g/L)调pH至4
14、.使着色剂完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酸胶粉。将吸附着色剂的聚酷胶全部转入G3垂融漏斗中过滤(如用G3垂融漏斗过滤可以用水泵慢慢地抽滤)。用pH4的70C水反复洗涤，每次20mL.边洗边搅拌。若含有天然着色剂，再用甲醇甲酸溶液洗涤13次，每次20mL，至洗液无色为止。再用70C水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇氨溶液分次解吸全部着色剂，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种着色剂混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述j在液置水39 GB/T 5009.35-1996 浴上浓缩
15、至2mL后移入5mL容量瓶中，用乙醇(50%)洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至J度。9. 3 定性9.3.1 纸包谱取色谱用纸，在Be底边2cm的起始线上分别点310L样品溶液、12L着色剂标准溶液，挂于分别盛有7.16.1、7.16.2的展开剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。也可取0.5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的左边点着色Ji!J标准溶液，依法展开，晾干后先定性后再供定量用。肯定蓝在碱性条件下易褪色，可用7.16.3展开剂。9.3.2 薄层色谱9. 3. 2. 1 薄层板的制备称取1.6 g聚眈胶粉、0.4g可溶
16、性淀粉及2日硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即宣涂布器中铺成厚度为0.3mm的板。在室温惊干后，于80C干燥1h，置干燥器中备用。9.3. 2.2 点样离板底边2cm处将0.5mL样液从左JlJ有点成与底边平行的条状，板的左边点ZL色素标准溶液。9.3. 2.3 展开克莱红与脑脂红用7.16. 4展开剂，使蓝与亮蓝用7.16. 5展开剂，拧橡黄与其他着色剂用7.16.6展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待着色剂明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如Rf值相同即为同一色素。9.4 定量9.4 1 样品测定将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10m
17、L比色管中，并加水稀释至刻度，作比色测定用。将薄层色谱的条状色斑包括有扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸着色剂，少量反复多次至解吸液子蒸发皿中，于水浴主挥去氨，移入10mL比色管中，:bu水至J度，作比色用。9.4.2标准曲线制备分别吸取0、0.50、1.0，2.。、3.0、4.0mL捆脂红、克莱红、拧糠黄、日落黄色素标准使用溶液，或0、O. 2、0.4、0.6、0.8、1.0 inL亮蓝、被蓝色萧标准使用溶液.分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(腼脂红510nm，宽莱红520 nm，梓橡黄430
18、nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，自在蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较.9.5 it算x ma 1000 -2 - m X V./V, X 1 000 式中，X2一一样品中着色剂的念量，g/I窜m，一测定用样液中色素的质量，mgJ叫一一样品质量体积hsG田L)，V，一一样品解吸后总体穗，tnI!. 吭一一样液点板(纸体积lrriL0;斗结果的表述z报告算术平均值的二位有效数。40 . ( 2 ) GB/T 5009.35-1996 附加说明s本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准第一法由天津市食品卫生监督检验所、辽宁省食品卫生监督检验所、宁夏回族自治区卫生防疫站、西安市卫生防疫站负责起萃，第二法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草d本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。41
