1、ISC 65.020.01 B 21 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1212一2006马铃薯脱毒种薯繁育技术规程(马铃薯脱毒技术规程、脱毒马铃薯基础种薯生产技术规程)Rules for multiplication of certified seed potatoes (Rules for virus eradication of potatoes. Rules for production of virus-free foundation seed potatoes) 2006-12-06发布2007一02-0实施中华人民共和国农业部发布NY/T 1212-2006 前言本标准附录A、
2、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G、附录H、附录I、附录J、附录K、附录L是标准的规范性附件。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准的起草单位:农业部薯类产品质量监督检验测试中心(张家口)、河北省高寒作物研究所。本标准主要起草人:尹江、张希近、姚瑞、马恢、高永龙。I NY /T 1212-2006 马铃薯脱毒种薯繁育技术规程1 范围本标准规定了马铃薯脱毒技术、脱毒马铃薯基础种薯生产技术。本标准适用于马铃薯脱毒技术和基础种薯生产。2 引用标准下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误内容)或修订版均不适用本标准，凡
3、不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 7331-87 马铃薯种薯产地检疫规程GB 3243-82 马铃薯种薯生产技术操作规程GB 4406-84 种薯GB 18133一2000马铃薯脱毒种薯NY/T 401一2000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程3 术语和定义3. 1 脱毒应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯的病毒病及类病毒病。3.2 脱毒试管苗经检测确认不带马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PV町、马铃薯卷叶病毒(PLRV)的试管苗。3.3 脱毒种薯脱毒试管苗生产的试管薯、微型薯、网室生产的原原种和继代生产供于大田用的种薯。3.3.1
4、原原种Pre-EIite 用试管苗在容器内生产的微型薯(Microtuber)和在防虫网室生产出符合质量标准的种薯。3.3.2 原种EIite 一级原种、二级原种。3.3.2.1 一级原种Elite 1 用原原种生产出符合一级原种质量标准的种薯。3.3.2.2 二级原种Elite II 用一级原种生产出符合二级原种质量标准的种薯。1 NY/T 1212-2006 3.4 病毒株允许率指马铃薯脱毒种薯回内病毒病株的允许比率。3.5 细菌性病害病株允许率指马铃薯脱毒种薯的繁殖回内细菌性病害病株的允许比率。3.6 混杂植株允许率指马铃薯脱毒种薯的繁殖回内混入不同品种植株比率。3.7 有缺陷薯指畸形、
5、次生、串薯、龟裂、虫口、惊伤、草穿、黑心、空心和机械损伤的块茎04 病害4.1 控制病害4.1. 1 病毒病指马铃薯脱毒种薯繁殖田内具有花叶、卷叶、条斑坏死病毒病的植株。4.1.2 马铃薯黑腔病(Eviniavar. atrosetica ( VanHall ) Dye)或(Erw切切var.carotovora (Jon臼)DyeJ。4.1.3 马铃薯青枯病(Fseudomonussolacearum E. F. Smith)。4.2 汰除病害4.2.1 马铃薯纺锤块茎类病毒(PotatoSpindle Tuber Viroid. PSTVd)。4.2.2 马铃薯环腐病(rynebcteri
6、umsepedonicum) (Sieck & Kott) (Skapt & Burkh)。4.2.3 马铃薯癌肿病(Synchytriumendbaiticum (Schilb.) Perc)。5 脱毒技术所用茎尖组织分生培养茎5. 1 培养基制备5. 1. 1 培养基分装:培养基分装子试管中，加盖管塞。5. 1. 2 ，肖毒:试管置于0.8kg/cm21.1 kg/cm2消毒锅120C高压灭菌20mino 5.2 取材5.2.1 取材于经审(认)定品种的腋芽或休眠芽。5.2.2 芽段用无菌水冲洗20min- 30min后，再用75%酒精浸蘸一下，放人无菌杯内用0.1%升求水浸泡5min，用
7、元菌水冲洗2次3次。5.3 组培室甲醒榕液熏蒸后，用紫外线灯照射40min。工作人员用肥皂水洗手，75%悟精擦拭消毒，操作用具置烘箱180C消毒。5.4 30倍-40倍双筒解剖镜下，解剖针剥离生长点，用解剖针切下0.1mm0.3 mm的生长点，接菌针将生长点移至试管。6 试管苗培养温度22t:-2SC ，光照时间16h/d，强度2000Lx-3 OOOLx，培养120d-140 d转接到MS培养2 NY IT 1212-2006 基的试管。7 脱毒苗的病毒鉴定试管苗按品种随机编号取样3管，采用酶联免疫吸附(ELISA)检验，无阳性反应再用指示植物鉴定;采用往复双向聚丙烯眈胶凝胶电泳法(R-PR
8、AGE)进行纺锤块茎类病毒复检，检出不带PVX、PVY、PVS、PLRV和PSTVd的脱毒苗。8 脱毒试管茵的繁殖8.1 将MS培养基配制成液，装人试管。8.2 置于0.8kglcm2- 1. 1 kg/cm2消毒锅灭菌20millo 8.3将试管茵置于超净工作台上，试管表面和管塞用75%酒精擦拭消毒，取出脱毒苗，按单茎切段，每个切段带1片小叶摆放在培养基面上。8.4 培养温度22C-25C，光照18h/d，强度2000Lx-3 OOOLxo 9 脱毒种薯生产9.1 试管薯生产设备、药品、试剂按附录L备制。9. 1. 1 操作程序9.1.2在超净工作台上将试管苗切段置于MS液体培养基的容器中，
9、每管8个茎段，植度22C-25C ，光照强度2OOOLx-3 OOOLx培养25d-30 d。9.1.3 茎段腋芽处长成4片-6片叶的小苗在无菌操作的条件下转接到结薯诱导培养基上，MS+I BA5mg几十CCC50mgIL十0.5%活性炭+8%蔚糖配制成液体，置于18C-20C, 16 h/d黑暗条件诱导结薯。9.2 微型薯生产基质是蛙石、珍珠岩、草碳土。9.2.1 建造温室，温室下覆0.08mm聚乙烯薄膜，上覆40目-45目尼龙网纱。9.2.2 与土壤隔离，均匀铺设5cm。9.2.3 挠足水达饱和状态。9.2.4试管苗在温室内炼菌7d，清洁水洗净培养基，按株行距6cmX7 cm栽入基质2cm
10、-2.5 cm 深，栽后小水细喷09.2.5栽植后遮阴网遮阴5d-7 d，温度保持22C-25C，相对温度85%，缓苗后每7d混灌营养液一次，自栽植后15d起，每隔7d喷施杀虫剂和杀菌剂一次。9.2.6 收额60d-80 d收获，按19以下、2g-4g、5g-9g、10g以上四个规格分级包装，拴挂标签，注名品种名称，薯粒规格，数量。9.2.7 收获后在通风干燥的种子库预贮15d -20 d后人害。9.2.8 人害后按品种、规格摆放，温度2C-3C ，温度75%。9.3 原原种生产9.3.1 炼苗温室地表洒水温润，管与管之间相隔5cm，温度18C-20C炼苗7do 9.3.2假植3 NY/T 1
11、212-2006 腐熟沃土装营养钵，钵高10cm、直径5cm，每m2300个，钵内浇足水，栽苗后小水细喷，遮阴5d-7d。9.3.3 管理温度25t-30t，相对湿度70%，苗高3cm-4 cm除尽杂草，松土，苗高5cm根部培沃土一次，10 cm出匾。9.3.4 定植苗龄32d-35 d，定植。9.3.5选地1500 m之内无高代马铃薯和十字花科作物。9.3.6 建立网室，以铜管为材，跨度9.5m，高度2m, 40目-45目尼龙网纱覆盖。9.3.7 施肥按马铃薯需N、P、K配方施肥，并防地下害虫。9.3.8 定植早熟品种667m25000株-5500株，中、晚熟品种4000株-4500株，随定
12、植烧透水一次。9.3.9 喷药定植30d后防治晚疫病，每隔7d喷施杀虫剂和杀菌剂。9.3.10 收在成熟后立即收获，用通气良好清洁卫生韧性较好的材料包装，加标签、标明品种名称、生产单位、检验人。9.3.11 预贮收获后先在风干种子库预贮7d-10 do 9.3.12 贮害要甲醒熏蒸，撒生石灰，喷杀菌剂，防鼠害，不同品种单贮，贮量为害容量的21309.3.13 保管贮藏温度3t，湿度70%，通风、窑内清洁卫生、防冻害。10 一级原种和二级原种生产10.1 种薯生产10.1. 1 500 m之内不种高代马铃薯和十字花科作物。10.1.2 播前种薯催芽。10. 1 . 3 30 g-50 g小薯整薯
13、直播，50 g以上块茎切种，单块重25g-30 g，每块带1-2个芽眼，刀具用高健酸伺榕被消毒。10.1.4 播种，10 cm地温稳定在5t为适宜播期，深度为9cm-10 cm。10.1.5 播种密度，早熟品种，667m25 000株-5500株，中、晚熟品种4000株-4500株。10.1.6 施肥，按设计产量N、PK配方施肥。10.2 田间管理10.2.1 全生育期中耕一次，培土两次。10.2.2 挠水和迫肥，田间土壤持水量60%-70%，现蕾期667m2追尿素10kg-15峙。10.2.3 去杂去劣现营至盛花期，两次拔除?昆杂植株与块茎。10.3 病虫害防治10.3.1 晚使病、蜡虫的综
14、合防治4 NY/T 1212-2006 出苗后40d每隔7d I费杀虫剂和杀菌剂。10.4 种薯田品种特征特性调查物候、植物、生物学恃性及病虫害识别，目测按标准附录H、标准附录I、标准附录K执行。10.5 种薯贮藏期间管理收获按9.3.11、9.3.12、9.3.13执行。11 种薯检验11 . 1 检验方法11 . 1 . 1 类病毒用往复双向聚丙烯酷股凝股电泳法(R-PAGE)检验(PSTVd)类病毒11 . 1 .2病毒病用酶联免疫吸附(ELISA)方法进行(PVX、PVY、PVS、PLRV)检验。11 . 1 .3 田间检验。11.1.3.1 原原种的检验，10000株以下随机取样2%
15、，10000株-100000株1%, 100000株以上0.5%按表1取样方法设点，将检验结果记录于表2中。表1不同繁种田面积的检验点蚊和检验植株数面积(hm2)检验点敢和每点抽取植株数0.1 hm2 随机抽样检验2个点，每点100株0.11-1 hm2 随机抽样检验5个点，每点100株1. 1-5 hm2 随机抽样检验10个点，每点100株二三5hm2随机抽样检验10个点，每点100株，超出5hm2的面帜，划出另一个检验区，按本标准规定的不同面积的检验点，抽取株数进行检验。11. 1.3.2 一级原种和二级原种的检验，全生育期三次检验，现蕾期、盛花期，枯黄期前两周，允许.率见表3。表2脱毒种
16、薯田间检验带病植株及混杂植株允许事第一次检验(现蕾期)病害及1昆杂株(%) 手I1薯类环病病腐毒级病毒病别植植梳株株株原原种。一级原利1。0.25 二级原种。0.25 11. 2 检验标准11 .2. 1 执行GB18133 11.3 检验程序果服病青枯病植株。O.5 O.5 1昆类病杂植毒植株株。O.25 。O.25 。第二次检验(盛花期)第一次检验(枯黄期前两周)病害及混杂株(%)病害J支据杂株(%) 黑黑环病脏1昆类环病胚?昆腐毒病病腐毒病病病青杂毒青杂枯植病病枯植植植病植植植病株株株株植株株株植株株。0.1 :S;O.25 。:S;0.1 0.25 。0.1 0.25 。0.1 0.2
17、5 。5 NY /T 1212-2006 表3马铃薯脱毒种薯田间检验原始数据记录表品种名称品种编号受检单位联系电话检验地点省县乡村检验时间检验类别检验依据样品数量代表面积AIhIrl种薯来源有元摄像照片田间栽培管理经过:检每点病毒病株数真、细菌病害病株数类病验检验1昆杂毒病检项株数花叶卷叶条斑黑腔青枯环腐癌1中验株数坏死株数点日数I E I H I E I H I E I H I H H I H I II I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 总计混杂.两次病株百重复分率合计或(% ) 平均备注L一一检验人:校核人:审核人:11 .3. 1 自繁自用种薯，由繁种单位自检，将检验记录报检
18、验部门备案，需要复检时，由检验部门派人复核检验。出售种苗、种薯由专职机掏和种子部门进行检验，签发检验报告。11.4 判定规则11.4.1 脱毒种薯分级以脱毒种薯繁殖团所播种的级别，带病植株比率和混杂植株比率为定级标准。11.4.2 各级别脱毒种薯的带病毒病株率，黑腔病和青枯病株率以及泪杂植株比率三项指标，任何一项不符合原来级别所定质量标准，但又高于下一级别质量标准者，判定结果按降低一个级别定级。11.4.3 种薯检验合格证马铃事脱毒种薯检验合格证马铃薯脱毒种薯质量检验合格证书年月日编号:种薯生产单位全称:省县村(单位)联系方式:种薯级别:|品种名称:|重量kg 经按中华人民共和国马铃薯脱毒种薯
19、GB/Txxxxx质量标准检验合格。12 包装、标签12.1 包装检验人:检验单位:联系方式:12.1. 1 用通气良好清洁卫生的材料。12.1.2标准袋净重35峙，内装标签。13标签(签字)(印章)150mm 13.1 标签选择韧性大、防雨防潮，不易涂改的材料制作。13.2 颜色原原种为白色、一级原种为绿色、二级原种为黄色。13.3 标签用蓝色圆珠笔填写，不得空项。13.4 标签平展正面置于扎口处。13.5 标签设计80mm 。马铃薯脱毒种薯种薯级别品种名称合格证书编号生产单位地址联系方式验收人80mm NY IT 1212-2006 8mm 110 mm 7 NY/T 1212-2006
20、附录A(规范性附录)酶联免使眼附试验法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 应用双抗体夹心法(IbubleAntilxxly臼ndwichMe也od)检测马铃薯脱毒苗是否带有PVX、PVY、PVS、PLRV等主要马铃薯病毒。A1 仪器和设备A1.1 聚乙烯微量滴定板:40孔和96孔，均可使用。Al.2 微量可调进样器:需2L-10L、10L-50L和10L-200L三种规格，并附相应规格的塑料头。Al.3 冰箱。A1.4 保温箱:温度设置为37C。Al.5 直径8cm的瓷研钵及钵锤。Al.6 酶联免疫检测仪:检测辣根过氧化物酶(HorseradishPerox
21、idase. HRP )标记的酶标记抗体用490 nm，波长检测，碱性磷酸(AlkalinePhosphatase AKP)标记的酶标抗体用405nm波长检测。A2 应用的化学试剂所用为分析纯级规格、用水为蒸锢水。A2.1 抗体免疫球蛋白(r-globulin)和酶标记抗体(Coniugate):从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，将其浓度调为1mg/mL，做为包被微量滴定板的抗体。用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体、浓度为1:1000以上，贮藏条件为4C0 A2.2碳酸盐包被缓冲液:pH9.6 , 1. 59 gNa叫(碳酸铀)，2.93刷刷叫(碳酸氢铀)加水至1Lo
22、 A2.3 PBS一TWeen20缓冲液，pH7. 4, 8 gNaCl (氧化饷)0.2 gKH2P04 (磷酸二氢饵)、2.2g Na2HP04 7H20 (磷酸氢二铀)或2.9gNa2HP0412H20，0.2gKCl (氧化饵)加水至1L，然后加o .5 mL Tween 20，洗涤微量滴定板用。A2.4 样品缓冲液:取PBSTween-20缓冲液100mL，加聚乙烯毗咯烧酣(PVP)2 g。A2.5 底物缓冲液:取0.2molILNa2HP04 12H20溶液25.7mL加0.1mollL拧橡酸榕液24.3mL加水50mL, pH调至5.0(现用现配)临用前加磷苯二股40mg, 30
23、%H20 , (过氧化氢)0.15 mL泪匀，避光放置。应为白色或微黄色溶液。A2.6 终止漉:为0.2mollL硫酸溶液，用1体积被硫酸加9份水。A3 操作步骤A3.1 包被微量精定板:把免疫球蛋白用包被缓冲液按1:1000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加人稀释的免疫球蛋白200Lo在37C条件癖育1h (或在4C条件下过夜)。A3.2 洗襟包被的微量滴定板:甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在吸水纸上敲打微量滴定板，除尽残留榕诚。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤缓冲液，停留30min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3次，以除尽未吸附的免疫球蛋白。NY/T 1212-2006 A3.
24、3 加被检测的样品A3.3.1 取样:在无菌条件下，从瓶苗上剪下长2cm茎段，放在小研钵内，把取样的试管苗放回原瓶内，封好瓶口，把样品编好号，以便检测结果决定取舍。A3.3.2 向小研钵内加样品缓冲液，加入液量依每个样品上样的孔数而定，例如每个样品准备上样一个样品孔时，可加人O.4mL样品缓冲液，研磨后可得200L清液，够上一个样品孔用。A3.3.3 加入检测样品:向编好号、洗涤完的微量滴定板的样品孔内，按样品编号、逐个加人提取的样品液200L，每一块微量滴定板上，可设两个阳性对照孔。两个阴性对照孔和两个空白对照孔。A3.3.4 把加完样品的微量滴定板，在37C条件下孵育4h-6 h (或在4
25、0C条件下过夜)，然后按A3.2洗涤微量滴定板。A3.3.5 加酶标记抗体:把酶标记抗体用样品缓冲液按1:1 000稀释，向每个样品孔中加人200L稀释的酶标记抗体。A3.3.6 洗涤微量滴定板:按3:2方法洗涤微量滴定板，以除掉未结合的酶标记抗体。A3.3.7 加底物:使用国产酶标检测仪器测定光密度时，向每一样品孔内加底物缓冲液100L。如果用进口Bio-Rad550型等进口酶标检测仪时则可加人200L底物，当观察到阴性对照孔与阳性对照孔显现的颜色可以明确区分时(辣根过氧化物酶标记的酶标记抗体显现楠红色，碱性磷酸酶标记的抗体显现鲜黄色)j或未设对照样品孔的微量滴定板的一些样品孔之间显现的颜色
26、可以明确区分时，每孔加入30L终止液，如加入200L底物缓冲液时则加入50L终止液(碱性磷酸酶标记的抗体一般可不加终止液)。A4 结果判定A4.1 目测观察:显现颜色的深浅与病毒相对浓度呈正比。显现白色为阴性反应，记录为一;显现谈情红色即为阳性反应，记录为十，依颜色的逐渐加深记录为+和+ A4.2 用酶联检测仪测定光密度值:样品孔的光密度值大于阴性对照孔光密度值的2倍、即判定为阳性反应(阴性对照孔的光密皮值应芝二0.1)。A5 计算结果:式中:I一一马铃薯病毒检出率，% j m一一呈阳性反应样品数量;一一实验室样品数量。1=旦X100% 结果用两次重复的算术平均值表示，脱毒苗病毒检出率修约间隔
27、为1，并标明经舍进或未舍未进。9 NY /T 1212-2006 附录B(规范性附录)往复双向聚丙烯酷股凝胶电泳法(Two-dimensional Polyacrylamide Gel Elecrophoresis) 应用本法检测脱毒苗是否感染有马铃薯纺锤块茎类病毒。Bl 范围规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)的检测方法。适于检测马铃薯纺锤块茎类病毒。B2 引用标准GB 18133-2000 马铃薯脱毒种薯NY /T 401-2000 脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程(检测方法引用NY/T401-2000) B3 原理类病毒分子在自然和变性条件下电泳迁移率不同，变性所引起类病毒核酸的
28、环状结构使其电泳迁移率明显慢于帧分子量的其他线性耻-.JA分子，因而第二向电泳中类病毒核酸的环状结构明显滞后，据此，结合可靠灵敏的银染色技术测定类病毒。B4 试剂本方法所用化学试剂为分析纯极规格，用水为蒸馆水，个别要求元商水。B4.1 盐酸溶液(HCl)= 1 +4J 量取盐酸10mL，加入40mL7_)(，棍匀。B4.2 核酸提取缓冲液!(CHzOH)3CNH31 = 12.11 g L-1，(C1O日14NzOsNaz2HzO) = 3.72 g L-i，(NaCl) =5.88 gL-1J 称取三捂甲基氨基甲烧(CH20HhCNH3 J 12.11 g，乙二股四乙酸二饷(ClOH14Nz
29、OsNaz. 2日20)3.72 g，氯化铀(NaCl)5.88 g榕于900mL7_)(中，用盐酸溶液(4.1)通过酸度计(5.1)调pH为9.0-9.5，定容至1000mLo B4.3 TAE缓冲液贮液pl(CHzOHhCNH31=48.46 gL寸，P (CH3C)Na) = 16.40 g L寸，(ClOH14N20sNaz 2HzO) = 7.44 g L-1 称取三是甲基氨基甲烧(CHzOH)3CNH3J48.46 g，无水乙酸铀(CH3COONa)16.40 g，乙二股四乙酸二铀(CtoH14NzOsNa22HzO)7.44g，溶于900mL水中，用冰乙酸通过酸度计(5.4)调p
30、H为8.1，定容至1000mL。B4.4 TAE缓冲破工作液!(CHzOH)3CNHa31=4.85gL-1，(CH30Na) =1.64gL-1， (ClOH14Nz乌Naz2HzO)=0.74gL -1J 量取TAE缓冲液贮液(4.3)200 mL，加水1800mL。B4.5 TBE电泳缓冲破贮液1(CHzOHhCNH31 = 107.8 g L1，(H3B03) = 55.0 g L寸，(ClO日14NzOsNaz. 2Hz 0) = 9.3 g L -1 J称取三起甲基氨基甲烧(CHzOH)3CNH3J107.8 g，棚酸(H3B03) 55.0 g，乙二腊四乙酸二铀(ClOH14Nz
31、OsNa22H20) 9.3 g榕于少量水中，定容至1000mLo B4.6 TBE电泳缓冲液工作被!(CHzOHhCNH31 = 10.78 g L-1，(H3B03) = 5 . 50 g L一1，(ClOH14NzOsNaz . 2H20) = 0 . 93 g L -1 J 量取变性电泳缓冲液贮液(4.5)200 mL，加水1800mL。B4.7 低盐溶液(NaCl)= 11. 7 g L -1 J 称取9.35g氧化铀(NaCl)潜于800mLTAE缓冲液工作液(4.4)中，0.1MPa灭菌30mino NY/T 1212-2006 B4.8 高盐梅液(NaCl)=87.75gL-1
32、J 称取氧化饷(NaCl)70.13 g，溶于800mLTAE缓冲液工作液(4.4)中，O. llv1Pa灭菌30millo B4.9 丙烯酌股贮液(CH2=CHNH2)=290.0gL-1, p (CH2=CHCONH2)zCH2= lO gL-1J 称取丙烯眈胶(CH2 = CHCONH2) 29.0 g，甲叉双丙烯耽股(CH2=CHCONH2)2CH2J19, 37C溶于100mL水中。冰箱冷藏室(5.13)保存。B4.10过硫酸锻溶液1(NH2)2 Sz0 81 =222.2 gL一1J称取过硫酸锁(NH2h乌08)1.0 g，梅于4.5mL灭菌水中，冰箱冷藏室(5.13)保存。B4.
33、11 四甲基乙二股CH3N(CH2)zNCH3J。B4.12核酸固定液(CH3CH20H)=10%，(CH3COOH) = 0.5% J量取50mL95%乙醇(CH3CH20H); 2.5 mL冰乙酸(CH3COOH)加水定容至500mLo B4.13 染色液(AgN03)=2.0 gL称取1.0g硝酸银(AgN03)擂于水，定容至500mLo B4.14 核酸显影液(NaOH)=16gL-1，(HCHO) =O.4%J称取8g氢氧化铀(NaO日), 榕于500mL水中，用前加2mL甲醒(HCHO)，现用现配。B4.15增色液p(Ha2C03) =7.5 g L -1 J取3g碳酸铀(Ha21
34、3)，榕于400mL水中。B4.16 指示剂(日7N2Na?马)=1.0gL寸，(49HlOsBr4S)=1.0gL寸，(42马2011)=0.4gL-1J称取100mg二甲苯兰(Cz5H27N2Na?Sz)、100mg f:臭酣蓝(49日1005Br4S)、40g蔚糖(42H220 11) ，榕于10mLTBE电泳缓冲液贮液(4.5)中，然后加入90mL水，r昆匀。B4.17琼脂糖梅液称取19琼脂糖，最取10mLTBE电泳缓冲液贮液(4.5)，加入90mL灭菌水中，加热溶解。B4.18聚丙烯眈胶凝胶量取丙烯眈胶贮液(4.9)8.3mL, TBE电泳缓冲液贮液(4.5)5mL，四甲基乙二胶(4
35、.11)50L60L，溶解并用元菌水定容至50mL r昆匀，灌胶前加过硫酸股悔液(4.10) 450L， r昆匀，立即灌胶，此液应现配现用。B5 仪器设备B5.1 DYY-I116B电泳仪和DYY-皿28C电泳槽。B5.2 TGL-16G高速台式离心机最高转速:21 000 r/millo B5.3 Sigma3K30高速冷蹄离心机控制范圃:(-2040)C，最大转速:30000 r/millo B5.4 PHS-3C酸度计量程:pH (014)，精度:+0.01 pHo B5.5 DL-101-2S电热鼓风干燥箱量程:RT+ 20C 300C，精度:士1C0 B5.6 移液器20此，40L，
36、 200L， 1000L。B5.7 752w紫外分光光度计量程220nm800 nm，精度:+2nm B5.8 一次性注射器5 mL, 50 mLo B5.9 量筒50 mL, 100 mL, 200 mL, 2000 mLo B5.10 容量瓶50 mL, 100 mL, 500 mLo B5.11 吸量管5 mL, 10 mL , 20 mLo B5.12 MDF-U332低温保存箱。B5.13 BCD-261冰箱。B6 试剂制备B6.1 样品粗提液制备取样品(脱毒苗、薯块的薯肉)3 g左右放人干燥的研钵中，加入液氮进行研磨。研碎后向小研钵中加入10mL核酸提取缓冲液(4.2)，SBS粉(
37、十二烧基磺酸铀)约0.1g、皂土约0.1g，再研磨6 mill10 millo向小研钵中加人120L-琉基乙醇，再研磨6mill10 millo加入11mL苯酣。研磨NY /T 1212-2006 6 min -10 mino加入12mL氯仿，再研磨6min-10 mino将研好的样倒人50mL干净的离心管中，用氯仿平衡。高速冷冻离心机(5.3)4C、9000r/mi丑-10000r/ mi且离心20min-25 min，用移液器(5.6)，将上层水相(样品粗提液)转移到另一清洁的离心管中，可现用，也可冻存(-20C)。B6.2 核酸纯化将6.1中有上清液的离心管拿出备用。在100mL元菌水中
38、加入一定量的可榕性纤维素，昆匀备用。装柱:用带孔的橡皮塞和细纱装人5mL的一次性注射器(5.8)，向注射器中加纤维素液，直至纤维素沉积至3.5mL左右处，期间要不断加入无菌水。上样:将上清破缓慢加入到柱中，直到加完为止。用低盐梅液(4.7)洗脱，每次加入2mL，共20 欠约40mL。待柱中低盐将流尽时，加人1rnL高盐榕液(4.8)进行清洗，然后将50mL干净离心管置于柱下分4次(每次2mL)加入8mL高盐溶液(4.8)，待高盐洗液全部流入50mL离心管为止。向装有高盐洗攘的50mL离心管中加入冻存的95%乙晖，加人量是离心管中液体的3倍左右，摇匀，放人低植保存箱(5.12)-20C以下冷冻，
39、时间不得少于2ho B6.3 总核酸提取将冻存的离心管拿出来，用95%的乙醇平衡，然后用高速冷冻离心机(5.3)1C -4C、10000r/min离心20min，倒掉上清液，将离心管倒立放在铺好的干净滤纸上。待水分吸干后，向离心管中加75%的乙醇，加入量是离心管容积的113，进行清洗，时间为10mi口-20min。用75%乙醇平衡，用高速冷晾离心机(5.3)1C -4C、10000r/min离心10min，倒掉乙晖，将剩余乙醇全部挥发掉。B6.4 试样摸得将TAE缓冲液工作液(4.4)200L加入到盛有总核酸的50rnL离心管中进行榕解，然后用移液器(5.6)将其移到1.5mL干净的离心管中，
40、再次用200LTAE缓冲液工作被(4.4)进行清洗，将清洗液全部转移到1.5mL离心管中。B7 测定步骤B 7.1 试料将盛有试样(6.4)的离心管在榄涡棍合器上振1昆匀，然后用高速台式离心机(5.2) 4 000 r /min 离心3min-5 mina 然后量取15L样品，用3000LTAE缓冲液工作液(4.4)稀释，以不加样品的TAE缓冲液工作班(4.4)为空白对照，紫外分光光度计(5.7)260 nm处，测定各试样光吸收值。1 A向阳x201 (RNA)!jgL-l=n n叮EVTnnn=8.04A260一般电泳加样试料的RNA质量(m)要求相对一致，据v=旦，计算试料体积(V)P B
41、 7.2 测定B 7.2.1 制板取洁净电泳槽，琼脂糖榕破(4.17)封底，注人聚丙烯眈胶凝胶(4.18)，反加样梳插人做成咏道。B7.2.2 加样按7.1中计算试料体积，11昆人指示剂(4.16)和TBE缓冲工作液(4.6)，总量为40L-60LoB7.2.3 正向电泳加入TBE电泳缓冲液工作被(4.6)，进行从负极到正极电泳，电泳仪(5.1)电压调到150V。当示踪染料二甲苯兰迁移到距凝股底部1cm-2 cm时，停止正向电泳。将电泳槽中缓冲液倒掉，把电泳槽置入电热鼓风干燥箱(5.5)中75C预热30min，然后向电泳槽中加人7忖5C的TBE援冲液工作液(仲4.6创)变性15m口1mB7.2
42、.4 反向电泳12 NY/T 1212-2006 在电热鼓风干燥箱(5.5)中进行从正极到负极的反向电泳，电泳仪(5.1)电压调至200V，当二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶板上方刚跑出水面时停止电泳，取出凝胶片进行染色。B7.2.5 固定把凝胶片放在置有400mL核酸固定液(4.12)的培养皿中，轻轻振荡10min，固定O.5h-1h，然后用50mL注射器(5.8)吸净固定液。B7.2.6染色向培养皿中加入400mL染色液(4.13)，轻轻振荡10min，染色列min-40 min，然后吸出染色被(可重复使用)。B7.2.7 漂洗用蒸锢水清洗凝胶板，以除掉残留的染色体，共冲洗四次，每次用水400m
43、L，每次冲洗15So B7.2.8显影加入核酸显影液(4 . 14) 400 mL，轻轻摇荡，直到核酸带显现清楚为止。B7.2.9增色吸出显影液，加入增色被(4.15)400 mL，增色5mino吸掉增色液拍照。B8 计算结果与阳性对照相同位置有谱带出现者为阳性。g=? m 式中:g一一一马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)检出率，%j h一一呈阳性反应样品数量;j一一实验室样品数量。结果用两次重复的算术平均值表示，彦约间隔为1，并标明经舍进或未舍未进。阳性对照(PSTVd的RNA)泳道下方约114处应有拖后的黑色核酸带。B9 判定采用全数值比较法，标准规定各级别种薯马铃薯纺锤块茎类病毒(PST
44、Vd)允许率应为零，检出变大于零。或经舍弃为零者均不合格。13 NY/T 1212-2006 附录C(规范性附录)马铃薯环腐病检测方法用格兰氏染色和茄子接种鉴定法结合起来鉴定马铃薯苗和脱毒种薯是否感染马铃薯环腐病。当用格兰民染色鉴定为阳性结果时，再用茄苗接种鉴定法进行鉴定，也产生阳性结果时，才能确认是马铃薯环腐病菌。C1 格兰民染色(Gran Stain) C 1.1 试验设备C 1. 1. 1 显微镜C 1.1. 2 载瑕片C1. 1.3 酒精灯C 1.2 试剂:所用试剂为分析纯级，用水为蒸锢水，个别为元菌水。C1. 2.1 龙胆紫染色液:2.5 g龙胆紫加水到1Lo Cl.2.2 碳酸氢铀
45、潜液:12.5 gN剧13(碳酸氢铀)加水到1L。C 1.2.3 腆媒染液:2 g腆榕解于10mL1MNaOH (氢氧化饷)榕液中，加水定榕为100mLo C 1.2.4 脱色剂:75 mL95%乙醇加25mL丙酬。C1. 2.5 碳性品红复染液:取100mL碱性品红95%乙醇饱和液，加水到1L。C 1. 3 取样制备涂片:所有试验用具都要用70%酒精擦拭灭菌。C 1. 3.1 鉴定植株:从地表上方2cm处割断，用慑子从切口挤出汁液，滴1滴于载玻片上，风干后，用酒精灯火焰烘炜2次-3次固定。另一方法是，从切口一端切下0.5cm厚茎片，在小研钵中研磨，吸取1滴汁液滴于载玻片上，风干，用四精灯火焰
46、烘炜2次-3次固定。C 1.3.2 鉴定块茎:切开块茎，如维管束处有菌服或渗出物，用慑子压挤，滴1滴于载玻片上，加1滴元菌水稀释，风干后，用火焰烘炜2次-3次固定。如无渗出物，用慑子从维管束附近取出一些碎组织放在载玻片上，加1滴元菌水，移掉碎组织。风干后，用火焰烘烤2次-3次固定。C 1. 4 涂片染色C 1.4.1 滴1滴龙胆紫与碳酸氢铀的等量?昆合液(现用现配)于载玻片上，染色20So C 1.4.2 滴1滴腆媒染液媒染20s，滴水洗涤。C 1.4.3 滴l滴脱色剂，脱色Ss-10 s，滴水洗涤。C 1.4.4 滴l滴碱性品红榕被复染2s-3 s，滴水洗涤，风干。C 1. 5 镜检和结果判
47、定:用1000倍-1500倍显微镜镜检，如见到呈蓝紫色的单个细菌或集聚为2、3或4个细菌，判定为阳性反应;染成粉红的判定为阴性反应。C2 茄子接种鉴定法C2.1 寄主植物准备:一般常用黑美人(Black Beauty)品种。先在大花盆中育苗，出苗后移植到装有营养土的花盆内，每盆1株。当茄子苗长到2周-3周出现第三片真叶时即可用于接种鉴定。C2.2 接种体制备:按C1.3.1与C1.3.2方法制备接种体，加适量无菌水稀释。C2.3 接种方法:用1mL卡介苗注射器吸人制备好的接种体，用4号针头，在茄苗真叶与子叶之间的茎部作针刺接种，每株茄苗针刺3个部位。接过种的茄苗放在20C-2SC的温室中，保持
48、相对湿NY/T 1212-2006 度70%以上，每日光照为12ho C2.4 症状表现及结果判定:接种后1周，第一片真叶缘出现水渍状症状，12 d后症状发展为叶缘或叶脉间失水萎藉，褪绿，22 d后发病部位坏死，叶片长成畸形。茄子接种后产生上述症状的，说明接种体中带有马铃薯环腐细菌，制备接种体的样品为阳性反应;无症状的为阴性反应，证明接种体中不带环腐细菌。15 NY /T 1212-2006 附录D(规范性附录)马铃薯青枯病检测方法01 范围本细则规定了马铃薯种薯块茎青枯病的检测方法。本细则适于检测马铃薯青枯病。02依据NY/T 401脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程。国际马铃薯中心(CIP)方法03原理青枯假单抱菌与其特异性兔抗体结合为抗原抗体复合物，抗原抗体复合物与特异的酶标羊抗兔抗体结合后遇底物引起显色反应。青枯假单抱菌越多，则颜色越深，反之，则颜色越浅，据此检测青枯病。04试剂所用化学试剂均为分析纯级规格，用水为蒸馆水，个别为无菌7.).004.1 次氯酸铀溶被(NaCIO)= 1 % 称取10g次氯酸铀，溶于990mL 7.)中o04.2 盐酸榕液(HCl) =1+1 量取37%盐酸50mL，加水定容至100mL。D4.3 TBS缓冲液(CH20HhCNH3工2.4
