1、SB中华人民共和国水产行业标准鱼类细菌病检疫技术规程20061206发布 2007-0201实施中华人民共和国农业部发布目 录第1部分：通用技术第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法第4部分：荧光假单胞藏赤皮病诊断方法第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断方法115253139ICS 6502030B 41S B中华人民共和国水产行业标准SCT 72012_2006鱼类细菌病检疫技术规程第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法Rules for quarantining bacterial diseases of fishPart 2：Diagnostic
2、 method for gill-rot disease20061206发布 20070201实施中华人民共和国农业部发布刖 吾SCT 720122006SCT 7201鱼类细菌病检疫技术规程分为五个部分：第1部分：通用技术；第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法；第3部分：嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病诊断方法；第4部分：荧光假单胞菌赤皮病诊断方法；第5部分：白皮假单胞菌白皮病诊断方法。本部分为SCT 7201的第2部分。本部分的附录A和附录B为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院长江水产研究所、中国水产
3、科学研究院珠江水产研究所。本部分主要起草人：何力、邹为民、徐忠法、姜兰、周瑞琼、罗晓松。1范围鱼类细菌病检疫技术规程第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法SCT 7201，22006本部分规定了鱼类柱状嗜纤维菌细菌性烂鳃病(bacterial gillrot disease)的诊断方法。本部分适用于鱼类细菌性烂鳃病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。SCT
4、7014-2006水生动物检疫实验技术规范ScT 720112006鱼类细菌病检疫技术规范第1部分：通用技术3病原体与流行情况31主要病原体柱状噬纤维菌(Cytoptmga columnaris)。曾用名：柱状嗜纤维杆菌、柱状屈桡杆菌、鱼害黏球菌。32流行情况在青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鲴、鳗鲡等鱼中都可发生，但主要危害草鱼；各地一年四季出现；水温20以上开始流行，28-35。C为最适流行温度。4试剂除非另有说明，在检验中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离子水。常用试剂与染色液的配制按SCT 720112006中附录A的规定执行。微生物生化鉴定管可代替相应的试剂。41辣根过氧化物酶(IM
5、P)标记的羊抗兔IgG抗体。42 1盐酸四甲基对苯胺。43 3，3一二氨基联苯四盐酸盐(DAB)酶底物(见附录A)。4 4 pH74磷酸盐缓冲液(PBs)(见附录B)。45 pH 76三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisHa)缓冲液(见附录B)。46兔抗柱状噬纤维菌抗血清。5培养基5 1胰胨琼脂培养基。5 2 Christensen氏枸豫酸培养基。5 3硝酸盐液体培养基。常用培养基的配制见SCT 720112006附录B中的B4。6设备和器械应符合SCT 720112006第4章的规定。】9SCT 7201220067采样遵照scT_一2006第4章的规定。8临床诊断8 1活动情况病鱼活动缓慢，对外
6、界的刺激反应迟钝，呼吸困难，食欲减退；病情严重时，离群独游水面，不吃食。82外部检查体色发黑，尤以头部为甚；鳃丝上黏液增多，鳃丝肿胀，末端腐烂，软骨外露；鳃丝上常附着有较多污物，不宜用水洗净；病情严重时，鳃盖内表面表皮充血发炎，中问常糜烂成一圆形或不规则的透明部分。83镜检剪取少量病灶处鳃丝放在载玻片上，加上2滴3滴无菌水(或清水)，盖上盖玻片，在400倍至600倍显微镜下观察。鱼体鳃上无大量寄生虫或真菌，放置20 min-30 rnin，可见鳃丝上有大量细长、滑行的杆菌，有些菌体聚集成簇状。9实验室诊断91病原菌的分离911平板划线分离取病鱼鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片的边缘约10 m
7、in，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养基平板上划线。可采用平板划线方法，不重复的划线，需尽量使其产生单个分散的菌落。在25恒温培养2 d3 d。912纯培养遵照SCT 720112006的723的规定。92菌落形态在胰胨琼脂培养基平板上25培养2 d左右，出现稀薄的、平铺在培养基表面的菌落，边沿不整齐，中央较厚，大小不一，颜色由浅逐渐变成黄色。93革兰氏染色在一干净载玻片上滴加一滴蒸馏水。用接种环取菌落少许与蒸馏水混合并均匀涂布，自然干燥，火焰固定；加草酸铵结晶紫染液染1 rain-2min，加水冲洗；加革兰氏碘液作用1 min-2min，加水冲洗；加复红酒精染液染50 s-60 s，加水冲洗。干
8、燥，镜检。菌体被染成紫蓝色为阳性，红色为阴性。94生化检验利用全自动细菌分析仪和细菌生化鉴定管可简化相应试验过程。941明胶液化试验在胰胨培养液中加入12的明胶，pH72，用高压蒸汽121、30min灭菌。取菌落接种培养2d-3d后用二氯化汞浇淹培养基，有液化明胶的区域出现为阳性。9 42酪素水解试验在胰胨培养基中加入2脱脂牛奶制成平板，接种2 d后，平板上有酪素水解的亮斑为阳性。943淀粉水解试验胰胨培养基加02可溶性淀粉。接种培养2 h-3 h加碘液于平板上，蓝背景中有明亮的水解区域为阳性。944七叶灵水解试验在05的胰蛋白胨，加01的七叶灵，005的柠檬酸铵铁，2的琼脂培养基上，接种培养
9、、观20SCT 720122006察7 d，菌落周围有黑色沉淀物为阳性。9 4 5几丁质分解试验用01的胰蛋白胨加入05几丁质，02琼脂的培养基盖于无营养琼脂平板上。接种培养、观察7 d。菌落周围出现透明圈为阳性。946分解纤维素的试验在胰胨培养液中加滤纸条。接种观察10 d，滤纸条有缺刻或断裂等分解现象为阳性。9 4 7酪氨酸分解试验在胰胨培养液中加05的酪氨酸，接种培养观察两星期(14 d)，酪氨酸被分解而透明为阳性。948硝酸盐还原试验在硝酸盐液体培养基上接种培养24 h后，滴加格里斯氏(Griess)试剂(配制见SCT 720112006附录A中的A2)各几滴。10 rain内显红色为
10、阳性。9，49靛基质试验1的胰蛋白胨水液，接种培养2 d后，滴加乙醚数滴，摇动，乙醚浮于上层，再沿管壁滴加Kovacs试剂约05 mL。两液接触处即刻呈玫瑰色为阳性。9，410硫化氢试验1的胰蛋白胨水液，接种培养2 d-4 d，用醋酸铅粉加入试管中观察。有黑色沉淀为阳性。941 1枸橼酸盐利用试验用Christensen氏枸橼酸培养基，接种培养，观察7 d。培养基由氯变蓝者为阳性。9 412过氧化氢酶试验取一杯培养物与310的过氧化氢混合，有气泡产生者为阳性。9 413葡萄糖利用试验胰胨液体培养基加1葡萄糖，0001 5溴麝香草酚蓝。培养基变黄色为阳性。9 5免疫学检验用弯头镊子取新鲜病鱼鳃上
11、的少量淡黄色黏液，涂于载玻片上，自然晾干；加几滴柱状噬纤维菌兔抗血清于该载玻片的涂片区，将载玻片置于湿盒内，在37温育30 min；用磷酸盐缓冲液(PIKS)洗3次4次，每次3min5min，再加几滴HRP一羊抗兔IgO抗体后，置于湿盒内，在37温育30min；用PBS洗3次4次，每次3min-5min，加几滴DAB酶底物，反应6min-8min，用pH76TrisHCI缓冲液洗30 min；加一滴甘油封存涂片区，覆上盖玻片。普通显微镜油镜下观察。10结果判定血清学检验，涂片上有棕色细长颗粒，颗粒大小与杆菌一致，或生化检验符合以下所有特性者可判定病原菌为柱状噬纤维菌：a)菌落形态特征符合92的
12、规定，革兰氏染色为阴性；b)明胶液化试验、酪素水解试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、硫化氢试验为阳性；c)淀粉水解试验、七叶灵水解试验、几丁质分解试验、分解纤维素试验、酪氨酸水解试验、靛基质试验、硫化氢试验、枸橼酸盐利用试验、过氧化氢酶试验、葡萄糖利用产气试验为阴性。临床诊断结果符合8的规定，病原菌为柱状噬纤维菌，可判定为细菌性烂鳃病。21SCT 72012_2006附录A(规范性附录)试剂的配制A1 DAB酶底物A 1 1配方A111 A剂：3，3一二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)30 mg。A11 2 B剂：pH76 Tris-HCl缓冲液40mLoA12配制A剂与B剂混合后避光搅拌3h
13、，储在棕色瓶中，放置于4冰箱。使用前溶液经单层滤纸过滤，取10 n1L滤液，加01 mL 03202，混合均匀。附录B(规范性附录)缓冲液的配制B1 pH 74磷酸盐缓冲液(PBS)B11母液的配制B11 1 A液：准确称取NaI-12P04820 276 g，加水至1 000 n1L。B1，1 2 B液：准确称取Na2I-IP0412H20 284 g，加水至1 000mL。B12缓冲液配制取A液19mL，B液81 n1L，NaCl 859，加水至1 000mL，混合均匀。B 2 pH 7 6Tris-HCI缓冲液B21母液的配制B 21 1 A液：准确称取三烃甲基氨基甲烷(Tris)2423 g，加水至1 000 mL。B212 B液：准确吸取36HCI 86mL，加水至1 000mL。B22缓冲液配制取A液25mL，B液375mL，加水至1 000mL，混合均匀。SCT 720122006
