1、ICS 6502030B 41SB中华人民共和国水产行业标准SCT 72031-2007对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分：PCR检测法20070614发布for Hepatopancreatic Parvovirus Diseaseof Penaeid Shrimp-Part 1：PCR Method20070901实施中华人民共和国农业部发布前 言SCT 720312007SCT 7203对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程分为三个部分：第1部分：PCR检测法；第2部分：组织病理学诊断法；第3部分：新鲜组织的T_E染色法。本部分为SCT 7203的第1部分。本部分的附录A为资料性附录。本部分由中
2、华人民共和国农业部渔业局提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本部分主要起草人：黄健、杨冰、陈爱平、宋晓玲、史成银、杨丛海、魏琦。对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第1部分：PCR检测法SCT 7203120071警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施并保证符合国家有关法规规定的条件。2范围SCT 7203的本部分规定了对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分适用于对虾活体、冰鲜虾产品及其粪便
3、和敏感宿主等样品中肝胰腺细小病毒(hepatopancreatic Parvovirus，HPv)带毒情况的定性检测。不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。3规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SCT 720222007斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法SCT 720322007对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法4原
4、理41对虾肝胰腺细小病毒病的病原和病理学特征见SCT 720322007(对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程第2部分：组织病理学诊断法)中31的规定。42技术原理按照SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：P(R检测法)中42的规定。5试剂和材料51所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外按照SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)中第5章的规定。52 10anolL引物F1：5。GGTGATGTGGAG GAGAGA一3，一2012保存。53 10 pmolL引物R1：5。GTAACTATCGCCGCCAAC一3，一20C保存。54阳性对
5、照为已知HPV阳性的组织或粪便样品的DNA模板，一20保存。55阴性对照为已知HPV阴性的组织或粪便样品的DNA模板，一2012保存。6仪器和设备所需仪器设备按照SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)中第6章的规定。1SCT 7203卜一20077操作步骤71反应体系的准备711 PCR反应可选择25止、50肛L或100,uL反应体系进行。71 2在PCR前区按表1的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。按10份支或100份伎分装，保存于一20。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的Taq酶，混匀，即成完全的
6、反应预混物。按1份伎分装到02mLPCR管中。如果PCR仪不具备热盖功能，再向各管内加入50止液体石蜡。暂存于413。表1 100份PCR反应预混物所需试剂组成试 剂 25“L体系 50止体系 100止体系 试剂终浓度10PCR缓冲渡(无M92+) 250止 500止 1 000且L 1xMGCl2(25 rmnolL) 400止 800止 1 600llL 40 rm-nolLdNTP(10mnlL) 50正 100止 200止 200maolL10pmolL引物F1 250止 500址L 1 000儿 1 vmolL10m,nolL引物Rl 250“L 500止 1 000止 1珊molL
7、灭菌双蒸水 1175址L 2 350止 4 700止Taq DNA聚合酶(5 U止，) 25止 50止 100止 005U儿L100份反应总体积 2 400止 4 800止 9 600止注：25止体系模板量1止反应管；50止体系模板量2止反应管；100止体系模板量4止反应管。72样品准备按照SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程定执行。73 DNA的提取按照SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程定执行。第2部分：PCR检测法)中712的规第2部分：PCR检测法)中713的规7。4 P(蕊扩增74 1在PCR前区，按照表1对各反应体系所需的模板体积要求，向各支含有
8、1份反应预混物的PCR管帽，分别加入相应体积的样品DNA提取液。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。742将上述加有样品模板的PCR管带入PCR后区，置于已预热到9413的PCR仪中保温5min，逐只依次快速取出并在手掌型离心机上短暂离心1 s2 s，使管盖上的样品模板混入反应预混物中，再立即放回预热的PCR仪中，继续在94(3保温5 min，再按以下程序进行扩增：94131 rain、601 mln、72131 mln，40个循环；7213延伸7 min，最后413保温。准备进行产物的电泳。75 PCR产物电泳按SCT 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)中7
9、15718的规定执行。8结果判定81阳性对照在628碱基对(bp)处会有一条特定条带出现；阳性样品在628 bp处会有特定条带出现；阴性对照和阴性样品在628 bp处应无条带出现，空白对照不出现任何条带。阳性对照在628bp处无特2SCT 72。312007定条带出现或阴性对照在628 bp处有条带出现都表明PCR失败，应在排除故障和清除污染后，重新取样检测。对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测产物序列参见附录A。82条带的亮暗表示扩增产物浓度的多少，但并不对应于模板的量的多少。83 阳性结果表明被检样品中存在HPV DNA。对活虾和敏感宿主而言，提示已受HPV感染；对冰鲜或冰冻对虾而言，提示曾受到
10、HPV感染。84电泳结果的分析和问题排除方法见表2。表2电泳结果分析实验结果 结果判读及原因分析 问题排除对虾样品阳性对照和阳性样品在628 bp处有条带， 1FCR反应正常，结果有效阴性对照和空白对照无628 bp条带1分子量标准失效或加样量太 更换分子量标准或增加其加样量阳性对照有条带，但分子量标准没有影像少1PCR反应失败 检查并更换PCR反应所用试剂以及分子量标准有影像，但阳性对照无条带 PCR程序是否正确2阳性对照失效 更换阳性对照，重新实验清洗微量移液器，只能用PCR后区的1微量移液器污染微量移液器取反应产物2试剂污染 更换试剂清洁实验室及所用仪器设备见SCT阴性对照或空白对照在6
11、28 bp处有条带出 3环境污染 720222007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)附录B现禁止从PCR后区到PCR前区的交流，4操作污染加强操作隔离检查提取DNA所用试剂情况，重新实1。DNA提取失败或降解验，确认样品新鲜程度阳性对照和阴性对照组正常，但已知带毒样 2DNA浓度过高 将样品稀释10倍以上品无条带3 PCR抑制物介人 稀释样品10倍以上，或重新提取DNA1未注意热启动操作，使PCR 做好热启动操作。样品先要加到PCR出现非特异性扩增 管盖上，反应预混物预热后，短暂离心(1s2 s)以混人样品，迅速放回预热FCR分子量标准正常，但阳性对照、阴性对照和 仪中样品
12、出现较多杂带或明显的弥散区 确认预混物制备的准确性、试剂质量，2酶活性idNTP浓度或M矿+浓度差异 对不同批次的酶重新测定最佳Mf+离子浓度3温度控制异常 检查FCR仪是否复性温度过低1紫外观察仪故障 检查紫外观察仪2背景发红太亮 减少E口用量，将琼脂糖凝胶置于清凝胶上无任何影像。包括DNA分子量标准 水中30 min后再观察结果3凝胶太厚 重新制作琼脂糖凝胶片4电极颠倒或电泳时间过长 改正电极方向，重新加样电泳5溴化乙锭(EB)分解失效 重新配制溴化乙锭(EB)a溴化乙锭(EB)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按SCT 7202 22007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第2部分：PCR检测法)
13、附录B的规定执行。3SCT 7203120074附录A(资料性附录J对虾肝胰腺细小病毒病PCR检测产物序列1 TCCGACTCGA GGGGGTGATG TGGAGGAGAG AATGTAACA TGCCTATGAA G埘脚GAAF161 CACAAGACTC ATATGTrCAG GAAGCCTGTA TnTrGACTA ATCAGCATCA CCCATYGGTA121 GACATATCAC ATFATGATGA CAGAAGAGCT ATAGAGAATA GAAGTITCAT GTATAAAGTA181 GAGTTAGGAA AGGAACCAGT AAATGCACAT ATAAAGTITC
14、 CTAATAGGAT GATrCCAATC241 AAGAAGAACC AGAACTAACG CAGITrGTAT 眦CAGCAT C,CAGTATGTr CATACAAACT301 ATATGAACAG ACCAGACAAC AAGTITAAAA TrGGAT兀盯 CAACAAC,CIT TATGACGCGC361 TGTrIBAGAA CAGCTAAAAC TATGTACC,CA GGGTFCAAGT T兀CCC,GCA TAAATAAAGT421 GATAAGATAA GATTGAGAGT TIGAATATCC ACGTCACACA CAAAGGTAGT ATACCAIGAG481 TCTAGTATGG GAGCAGTCGT ATCTGCAGTr GCTGCAGTAA TAGCTGTAGT AGTCGAAGTC541 TCGAGTrCAT AGTCGATGTC GTGGAAGTC,G CUITCGTGGT CGCAGAAACT GTACAGGTCG601 TTGCAGACAC AGTCGATrAC TlqGTIGGCG C,CI酬J*G删R1661 CAATCCGAAG ACGGAGGGAG CTAACGAAAT TAACGACAGA ACGACATC
