1、GB 12743-2003 前言本标准代替GB12743-1991大豆种子产地检疫规程队GB 12743 1991大豆种子产地检疫规程已执行了十余年，目前，大豆上的危险性有害生物种类已经发生了变化，检验检疫技术也有了发展和提高，原规程已不适应大豆生产发展的需要，特对原标准进行修订。修订后的标准增加了1995年新公布的国内检疫对象一一大豆疫病，该病也是我国1993年公布的一类进境植物检疫对象；同时，由于大豆菌核病是土传病害，种子本身并不带菌传病，因此修订后不再列为应检有害生物。有害生物的综合治理措施也做了相应的调整，增加了一些新的技术内容本标准的附录B、附录C为规范性附录，附录A为资料性附录。本
2、标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部种植业管理司归口。本标准负责起草单位全国农业技术推广中心、东北农业大学、辽宁省植保植检站、吉林省植物检疫站、黑龙江省植保植检站、农业部大豆种子质量监督检验中心、黑龙江省富锦市植保站。本标准主要起草人z王福祥、吴立峰、文景芝、蔡明、吴雨泉、杜淑梅、孙波、万振家。本标准委托全国农业技术推广服务中心负责解释。本标准1991年首次发布，本次为第一次修订。GB 12743-2003 大豆种子产地检瘟规程1 范围本标准规定了大豆种子产地的限定性有害生物种类、健康种子生产、检验、检疫、签证等。本标准适用于实施大豆种子产地检疫管理的植物检疫机构及繁育、生产大豆种子
3、的单位和个人。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1 产地因植物检疫的目的而单独管理的生产点2. 2 产地撞疫植物检疫机构对植物及其产品（含种茵及其他繁殖材料，下同在原产地生产过程中的全部工作，包括田间调查、室内检验、签发证书及监督生产单位做好选地、选种和疫情处理等工作。2. 3 有害生物任何对植物或植物产品有害的植物、动物或病原物的种、株（晶）系或生物型。物生童盲有性疫检仨rJ4寸定限或物生物害生有害性有疫性检定种限AU叮肉，2. 5 检疫性有害生物对受其威胁的地区具有潜在经济重要性、但尚未在该地区发生，或虽己发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。2. 6 限定非检瘦性有寄生物
4、一种非检疫性有害生物，但它在供种植的植物中存在，危及这些植物的预期用途而产生无法接受的经济影响，因而在输入方境内受到限制。2. 7 健康种子按本标准所列检验方法检验，符合本标准对限定性有害生物要求的大豆种子。3 限定性有喜生物3. 1 检疫性有害生物z大豆疫病Phytophthora sojae Kaufm. & Gerd. 莞丝子属Cuscuta spp. 3. 2 限定非检疫性有害生物2大豆病毒病Soybean virus disease 大豆霜霉病Peronos户oramanschurica (Naum. )Syd GB 12743-2003 大豆灰斑病Cercospora sojina
5、 Hara 3. 3 省里补充的其他检疫对象。4 健康种子生产4. 1 繁育地选择4. 1. 1 繁育地设在排灌条件良好、土壤肥力中等的地块，并翻耕晒土。4. 1. 2 繁育地选择连续种植禾谷类作物二至三年以上的地块，无本标准所列的检疫性有害生物发生。4. 1. 3 避免邻作是限定性有害生物的寄主（如向日葵和油菜等），并保持100m内无大豆的隔离条件。4. 1. 4 产地检疫申报z种子繁育单位或个人应在播种前一月向当地植物检疫机构申请产地检疫，并填写申报表（见表1)。申报号z作物名称：表1产地检瘦申报表申报单位（农户卜联系人：联罪电话g种植地点种植地块种植面积品种种苗编号667 m（亩）来源合
6、计植物检疫机构审核意见z预计播期审核人t植物检疫专用章年月日注I，丰表一式二联，第一联由审核机关留存第二联交申报单位注2，本表仅供当季使用。4. 2 种子健靡标准4. 2. 1 原原种不带本标准所列的限定性有害生物，无斑驳。地址g预产隔离条件种于量kg4.2.2 原种2元疫霉菌、荒丝子种粒，霜霉病、病毒病发病率要分别低于3%和0.2%，灰斑病发病率、种子斑驳率低于3%。4.2.3 一般良种z无疫霉菌、苑丝子种粒p霜霉病、病毒病发病率要分别低于10%和o.5%，灰斑病发病率、种子斑驳率低于5%。4.3选种4. 3. 1 原原种自上一年无限定性有害生物的大豆田中大豆健株上采集，经检疫证明符合原原种
7、健康标准。4.3.2 原种及一般良种采自上一级符合标准的种子田。4.4 防疫措施4. 4. 1 播种前用筛子、选种机等机械或人工办法粒选，汰除混人的杂质。4. 4. 2 播种前用药剂拌种，防止大豆疫病或其他有害生物危害。4. 4. 3 在幼苗期，及时拔除病苗杂草。4. 4. 4 在大豆花期以前，如果有甥虫发生，应对种子回及保护带施药灭甥。4. 4. 5 盛花期遇潮湿天气，田间灰斑病病叶率达到30%时，应施药防治。GB 12743-2003 4.4.6 开展大豆疫病田间监测，发现可疑株，应进行土壤检测，一旦确认立即销毁病株并进行土壤处理。4.4. 7 当田间发现苑丝子时，少的随即被除多的连同大豆
8、一起销毁e4.4.8 对田块内的大豆残株及落叶等应及时清除、烧毁，避免串回灌溉，并及时防治其他有害生物。5 检查、检验、签证5. 1 检查以农业植物检疫部门为主，种子部门、生产单位（农户）协助。5. 2原原种逐行逐株目测，原种、一般良种采用棋盘式抽样检验，检验区面权不得大于33.33 hm, 0. 67 hm以下取5点，0.67 hm2 6. 67 hm2取8点，6.67 hm2 13. 33 hm2取11点，13.33 hm2 33. 33 hm2取15点，每点检验株数不得少于200,33. 33 hm以上可根据各方面条件的均匀程度，另外划分检验区。5. 3 检查时期z在大豆整个生青期间，要
9、进行限定性有害生物发生情况的系统调查。在幼苗期、盛花期、鼓粒成熟期进行三次田间检查，田间症状详见附录A，将检验结果填入大豆种子田间检验记录表（见表2）。表2大豆种子田间检验记录表面.j!U种子调查时期亩产量质量地点品种hm2 处理级别调查项目播前开花结英收获kg 等级种子苗期盛期盛期种子检查株（粒）数芫丝于种（楝数疫病率（%）霜霉病率（%）灰斑病率%）种于斑驳率（%）病毒种传率（%其他调查日期调查人5. 3. 1 幼苗期检查z检查有无限定性有害生物的可疑症状，如发现有则按4.4的有关防疫措施处理。5. 3. 2 盛花期检查z检查大豆疫病和荒丝子并按照4.4的有关防疫措施及时处理。病毒病检验以盛
10、花期为主，该期原种及良种田田间病株率可作为该地块种传率预测的依据，原种及良种困花期病毒病株率应分别低于！%和3%。灰斑病于花期检查后，根据病情和当地气象预报决定是否应进行药剂防治。5. 3. 3 鼓粒成熟期检查2检查大豆疫病并按照4.4给出的防疫措施及时处理。5. 4 田间不能确诊的限定性有害生物样本带回实验室，做室内检验（大豆疫病检测方法见附录B，病毒病检测方法详见附录C，其他有害生物按常规方法进行）。检验结果填人大豆室内检验报告单（见表3）。GB 12743-2003 亵3产地检疫室内检验报告单对应申报号z样本编号3取样日期：作物名称作物品种：取样部位：检验方法检验结果2备注2检验人（签名
11、审核人（签名），植物检疫专用章年月日5. 5 签证5. 5. 1 凡检查、检验发现大豆疫病者不予签证。5.5.2 病毒病检验以田间为主，必要时做室内检验，若病毒病不符合本标准要求，不应签证。5.5.3 发现莞丝子经严格处理合格，可以签证。5.5.4 凡经过田间检验及室内检验后，收获的种子符合健康种子标准的，发给产地检疫合格证（见表4）。表4产地检疫合格证有效期至年月日检疫日期国年月日检（）字第号作物名称品种名称种植面积田块数目种苗数量kg（株种苗来源种植单位负责人检疫结果签发机关（盖章）检疫员年月日注z本证式两联，第一联交生产单位凭证换取植物检疫证书，第二联留存检疫机关备查。本证不作植物检疫证
12、书使用5.5.5 若检验没有发现检疫性有害生物，但发现限定非检疫性有害生物的，记录下结果，不予签发产地检疫合格证。调运时，检疫机构视是否符合种子调入地检疫要求确定是否签发植物检疫证书。GB 12743-2003 附录A（资料性附景）大豆限定有曹生物的田间症状A.1 大豆疫街幼苗期，幼苗出土前后猝倒，根及下胚轴变褐、变软，真叶期被害幼苗茎部呈水渍状，叶片变黄，严重者枯萎而死。成株受害时，往往在茎基部发病，出现咖啡色病斑，并向上下扩展，病茎髓部变褐，皮层和维管束组织坏死、叶片变黄下垂但不脱落，根部受害变黑褐色，病痕边缘不清晰。A.2 冤丝子茎线状，直径1.0 mm 1. 5 mm，黄色、淡橙黄色或
13、黄绿色，光滑元毛，在寄主茎上向左缠绕，叶鳞片状，膜质。花黄白色，多数簇生一起，呈绣球形，种子为小型葫果。A.3 大豆霜霉病A.3.1 幼苗沿叶片主脉两侧出现褪绿块斑，扩大后叶片全部变黄，病叶背面密生灰白色霉层，病株矮化，叶皱缩，封垄后死亡。A.3.2成株s叶片上病斑散生，呈圆形或不规则形的黄绿色小斑点，叶背有灰白色霉层，呈星芒状。发病重的，病斑可汇成更大病块，病叶干枯，被害籽粒表面粘附有灰白色霉层。A.4 大豆灰斑病叶背病斑色较深，生有黑灰色霉层（即分生抱子梗和分生于包子），干枯时破裂成孔。初在叶片表面生圆形小斑点，后扩大。中心变灰色或灰褐色，周缘成赤褐色，圆形、椭圆形、多角形或不规则形，英上
14、病斑为圆形，褐色，有深褐色轮廓。茎部病斑呈纺锤形，黑褐色，逐渐发展绕茎一周。种子上的病斑为褐色圆形，边缘深褐色，轻病粒仅产生褐色不规则形小点。A.5 大豆病毒病A.5.1 大豆花叶病毒病侣。ybeanmosaic virus) A.5.1.1 病苗症状大多数病苗在第12复叶展开后都已显症，气温持续在25以上时则隐症或延迟显症，病苗单叶两侧向下纵卷成筒状，或倒三角形，单ut及复叶可有斑驳、花叶，或背面叶脉局部坏死，而引起叶片向下弯曲。A. 5. 1. 2 成株症状花叶型2花叶、斑驳、黄斑、矮化、皱缩。顶枯型叶脉坏死，自茎顶部生长点i向下坏死，也可弯曲。A.5.2 大豆矮化病毒病（Soybeans
15、tunt vir皿单叶扭曲，叶背脉部分坏死，叶片沿脉抽缩，复叶轻性斑驳，或叶脉退绿，成株期呈顶枯状，与大豆花叶病的顶枯型相同。A.5. 3 其他病毒病由不同病毒引起。GB 12743-2003 A.5. 3. 1 花生轻性斑驳病毒病（Peanutmild mottle virus) 叶上有黄斑、枯斑、脉坏死、斑驳或皱缩。A. 5. 3. 2 曹宿花肘病毒病（Alfalfamosaic vir皿）叶片上呈现黄色斑驳或花叶。附录B（规范性附录）大豆疫病实验案检验方法B.1 病原菌分离和培养B. 1. 1 从病组织分离选择典型病株，切取病斑边缘病健组织交界处约5cm长的一段组织，放人滤网中，自来水冲
16、洗10 min，然后切成0.5 cm见方的小块，放入0.1%次氯酸铺水溶液中浸泡。.5min 1 min后取出，立即放入无菌水中冲洗3次4次，用选择性培养基进行分离，室温2225下培养3d，在实体解剖镜下观察，挑取疫霉茵丝，转移到胡萝卡CA）或利马豆（LA）培养基上繁殖。B.1.2从土壤分离将土壤风干，研碎，过筛孔径2mm），加蒸馆水润湿，使土壤含水量达到或接近饱和，24C26光照条件下培养4d 6 d后，加适量蒸锢水浸泡，浸泡水面高出土表不超过1.5 cm，加感病大豆品种5 mm ”f碟诱集6h 12 h，取出叶碟，光照条件下用无菌水培养，1d 3 d后镜检叶碟边缘有无抱子囊。若有，则吸取游
17、动袍子悬浮液，涂于选择性培养基上，2426黑暗条件下培养4h 12 h，显微镜下选择己萌发的单个袍子，用接种针挑取含单个抱子的琼脂块转移到选择性培养基上，25黑暗条件下继续培养，4h 6 h后继续转皿纯化。取得单游动抱子菌株后，以形态和致病性作最终鉴定。B. 2 鉴别特征大豆疫霉菌在PDA培养基上生长缓慢，气生菌丝致密，幼龄菌丝无隔多核，分校大多呈直角，分校基部稍有缝缩，菌丝老化时产生隔膜，并形成结节状或不规则膨大。膨大部球形、椭圆形，大小不等。菌丝体宽3m 9 m。可以产生厚垣于包子。该菌在利马豆培养基和自来水中可以形成大量抱子囊，抱囊梗单生，无限生长，多数不分枝，袍子囊顶生，jjj梨形，顶
18、部稍厚，乳突不明显。新抱子囊在旧袍子囊内以层出方式产生，抱子囊不脱落，（2389) m 07 52) m，平均58mX38 m。游动于包子在泡子囊内形成，卵形，一端或两端钝尖，具两根鞭毛，茸鞭朝前，尾鞭长度为茸鞭的4倍5倍。利马豆不易购得，可以用“自芸豆琼脂培养基”代替。该培养基用于豆吸胀24h，取吸胀豆150g, 加300mL蒸馆水，用高压灭菌锅121煮20min，双层纱布过滤，滤汁加水补足至I000 mL，加琼精制成含2%琼脂的培养基。在臼芸豆琼脂培养基平板上，菌落边缘整齐，菌丝致密，气生菌丝白色，菌落前沿有环形半透明带（淀粉利用带），菌落上可产生大量卵抱子。用胡萝卡或利马豆固体培养基培养
19、一周后可产生大量卵抱子。藏卵器壁薄，球形至扁球形，直径29 m 46 血，一般在40m以下。雄器则生，长形或圆形。卵抱子球形，直径19m38m，有光滑的内壁和外壁，淡黄色，壁厚1m 3 mo由于常规洗涤检验也可洗下大豆霜霉菌卵抱子，为免混淆，可根据表B.1进行到别。GB 12743-2003 亵B.1疫霉菌和霜E菌卵抱子比较项目疫霉菌卵抱于精霉菌卵抱于卵抱于直径pm23. 2 31 9 23 2 29. 0 卵抱于壁厚pm2. 3 3. 2 I. 3 2. 6 卵抱于形态及颜色球形、黄褐色球形、被黄色卵抱于着生部位及特点种皮里面、分散种皮表面、集中成堆病种于表面特征无霉层灰自色干精状霉层B.
20、3 常用培养基及其配方B. 3. 1 胡萝卡琼脂培养基（CA）：胡萝卡200g，加200mL蒸馆水组织捣碎，过滤，汁液中加20g琼脂加热融化，蒸馆水补足至1000 mL，分装灭菌30min。B. 3. 2 利马豆琼脂培养基（LA）：利马豆25g，加水浸胀后加入1000 mL蒸馆水，高温灭菌30min，过滤，加20g琼脂，将溶液体积补充至1000 mL，高温灭菌30min。B. 3. 3 在CA或LA培养基中添加不同药剂即配置成多种选择性培养基，常用的有以下几种sB. 3. 3. 1 PARP选择性培养基g在CA或LA基础培养基中添加匹马霉素（Pimaricin)lOmg/L，安比西林（Ampi
21、cillin)250mg/L，利福平（Rifampicin)10 mg/L，五氯硝基苯（PCNB)50mg/L0 B. 3. 3. 2 PARPH选择性培养基在CA或LA基础培养基中添加匹马霉素（Pimaricin)10 mg/L，安比西林（Ampicillin)250mg/L，利福平（Rifampicin)10 mg/L，五氯硝基苯（PCNB)50mg/L，恶霉灵(Hymexazoll 50 mg/Lo B. 3. 3. 3 PBNC选择性培养基g在LA基础培养基中添加五氯硝基苯（PCNB)20mg/L，苯莱特（Benlate)5 mg/L，硫酸新霉素（NeomycinSulfate，新丝霉
22、素)100mg/L，氯霉素（Chloroampheicoll 10 mg/L 0 附录C（规范性附录）大豆病毒病种传率的检测技术C.1 检测范围原原种和原种。C.2 器材C.2.1 防虫温室或网室。C.2.2 河沙、砾石、珍珠岩或消过毒土壤，任选一种。C.2.3 花盆或塑料果盘（长方形，约长45cm、宽33cm、高10cm，底有细孔）供播种。C.2.4 消毒钵体。C.2.5 电镜。c. 2. 6 硅藻土或金刚砂（400目600目）。C.2.7指示作物莱豆品种“monroebean”，供试幼苗，要求在防虫温室培育，在单叶到一片复叶时使用。C.3 检测步骤以生长试验为主，必要时进行指示植物反应、血
23、清反应和电镜观察。GB 12743-2003 C.3.1 生长试验巳3.1. 1 取种样z原原种按种重1/10，最多不超过500粒g原种取500粒。c. 3. 1. 2 播种2在防虫条件下播种和培育幼苗。种距约3cm 5 cm。即于上述规格的塑料果盘中每行播10粒，10行，共播100粒盘。其他盘则以此类推。培育温度不低于15，不高于28，以1823为宜c. 3. 1. 3 观察记载z第一次于单叶展平时，记下症状明显的病苗数，第二次于第一复叶平展时，记下症状明显的病苗数，拔除病苗和健苗，留下可疑而未确定的苗。c. 3.2 接种指示植物取可疑茵的叶片少许，在加有少许金刚砂（或硅藻土）的消毒研钵中研
24、成汁液状，常规接种菜豆“ monroe bean”。观察指示植物接种叶的病斑或幼叶的系统症状，判断可疑苗是否有病毒病。C.3.3 琼脂双扩散血清反应平皿中倾人熔化的培养基（NaN,1% ,SDSO. 5%，优质琼脂粉0.8%，蒸馆水配制）。凝固后打二或四组孔，中央孔滴人抗血清，四周孔滴入待测植株的汁液。每克叶片加lmLpH7.27.4的磷酸缓冲液研磨，并加1mL3%SDS液处理，吸出汁液，加入平皿孔中（测定球状病毒时不用SDS处理）。平皿加盖，放2537孵育1d，样品孔与中央孔（抗血清）之间出现沉淀线为阳性反应。c. 3.4 电镜观察切取一小块(1mm 3 mm）叶片，放入一滴2%3%的磷鸽酸（PTA）液中，用玻棒捣碎叶组织，取液滴放在被有福尔马膜的铜网上，浮载30s，取出吸去多余的液体，即可在电镜下观察。如观察CMV,可用乙酸铀2%液染色
