1、中华人民共和国国家标准水质物质对蚤类大型蚤急性毒性测定方法发布实施国家环境保护局发布中华人民共和国国家标准水质物质对蚤类大型蚤急性毒性测定方法国家环境保护局批准实施本标准参照采用国际标准水质大型蚤运动抑制的测定本标准用大型蚤为试验生物测定物质或废水的半数抑制浓度半数致死浓度或用于判断物质或废水的毒性程度适用范围本标准适用于以下范围在试验条件下可溶的化学物质包括工业原料和产品食品添加剂农药医药等工业废水生活污水地表水地下水原理指在或内百分之五十的受试蚤运动受抑制时被测物的浓度运动受抑制反复转动试验容器之内失去活动能力的大型蚤被认为运动受抑制即使其触角仍能活动也应算做不活动的个体指在或内百分之五十
2、的受试蚤死亡时被测物的浓度以受试蚤心脏停止跳动为其死亡标志试验材料试验生物为大型蚤甲壳纲枝角亚目保持良好的培养条件使大型蚤的繁殖被约束在孤雌生殖的状态下见附录选用实验室条件下培养代以上的出生的幼蚤为试验蚤试验蚤应是同一母体的后代试验用水配制人工稀释水为试验用水新配制的标准稀释水为硬度以计比例接近溶解氧浓度在空气饱和值的以上并不含有任何对大型蚤有毒的物质人工稀释水用电导率以下的蒸馏水或去离子水以下简称水按下述方法配制氯化钙溶液将氯化钙溶于水中稀释至硫酸镁溶液将硫酸镁溶于水中稀释至碳酸氢钠溶液将碳酸氢钠溶于水中稀释至氯化钾溶液将氯化钾溶于水中稀释至各取以上四种溶液混合稀释至必要时可用氢氧化钠溶液或
3、盐酸溶液调节值使其稳定在标准稀释水应容许大型蚤在其中生存至少并尽可能检查稀释水中不含有任何已知的对大型蚤有毒的物质例如氯重金属农药氨或多氯联苯如果所进行的试验需要使用其他稀释水或改变稀释水的应在试验报告中注明所用稀释水的性质要求稀释水的硬度在以计范围内比例接近不得低于或不得高于同一试验波动不得大于重铬酸钾分析纯试验液的制备试验物质溶液的配制试验物质可以是可溶于水的固体液体或气体但要求组分一定具有代表性重复性易溶于水的试验物质可直接加到稀释水里也可以溶解在蒸馏水或去离子水中配成贮备液加入到稀释水中配成试验液每升稀释水中的贮备液要少于贮备液应当低温保存难溶于水的物质可用适当的方法将其溶解和分散包括
4、使用超声波装置及其他低毒溶剂增溶如果使用溶剂溶剂在试验液中的浓度不应超过并应在试验的同时设两个对照组一组用稀释水另一组用最大浓度的溶剂工业废水试验液的制备样品的采集及处理采集废水样品时应将采样瓶充满水样不留空气样品采集后应立即进行试验如果样品采集后之内不能进行试验则必需将水样冷冻保存并应尽可能缩短水样在试验前保存的时间生产流程用水不稳定的工业废水应在之内每隔瞬时采样一次分别测定每个样品求得其最大毒性废水样品可以用稀释水稀释配成不同浓度的试验液试验容器和仪器试验容器可采用小烧杯或结晶皿等玻璃制品加盖表面皿为防止玻璃容器对试验物质的吸附试验前可用低浓度试验溶液浸泡一天试验结束后立即倒空容器刷洗消除
5、任何微量的试验液量筒容量瓶移液管吸管玻璃缸尼龙筛网等器皿溶解氧测定仪计温度计电导仪环境条件试验温度要求基本稳定变化不超过试验前的培养温度要求与试验温度基本一致毒性试验在或下进行实验在没有对大型蚤有害的气体粉尘的大气条件下进行试验在自然光照或相当于自然光照下进行避免阳光直射每天光照左右大型蚤在试验前应与试验条件一致的环境中驯养试验操作及试验过程中蚤类不能离开水转移时要用玻璃滴管预试验正式试验之前为确定试验浓度范围必须先进行预备试验预备试验浓度间距可宽一些如每个浓度至少放个幼蚤通过预试验找出被测物使大型蚤运动受抑制的浓度和最大耐受浓度的范围然后在此范围内设计出正式试验各组的浓度预试验中应了解毒物的
6、稳定性在标准稀释水中是否会出现沉淀等理化性质的改变以便确定正式试验是否需要采取流水或更换试验液及改变稀释水等措施正式试验试验浓度的设计根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围按几何级数的浓度系列等比级数间距设计个浓度如等比级系数为又如等比级数系数为试验浓度要设计合理浓度系列中以能出现一个左右和左右大型蚤运动受抑制或死亡的浓度最为理想试验用烧杯或结晶皿装试验液置蚤个每个浓度至少有个平行一组试验液设一空白对照内装相等体积的稀释水试验前要用化学方法测定试验液的初始浓度试验开始后应于及定期进行观察记录每个容器中仍能活动的水蚤数测定大型蚤不活动或死亡的浓度范围并记录它们任何不正常的行为在计算试验蚤的不活动
7、或死亡的百分数之后立即测定试验液的溶解氧浓度检查大型蚤的敏感性及试验操作步骤的统一性定期测重铬酸钾的目的是验证大型蚤的敏感性在试验报告中报告重铬酸钾的为条件下按照第章所叙述的步骤进行验证检查如果重铬酸钾的在以外则应检查使用试验步骤是否严格并检查大型蚤的培养方式如有必要使用新的符合敏感要求的大型蚤品种数据结果的处理及有效性的估算试验结束计算每个浓度中不活动的大型蚤或死亡蚤占试验总数的百分比用概率单位目测法计算或见附录也可用计算机或程序处理寇氏修正法获得或结果的表示以或表示物质在相应时间内对大型蚤运动受抑制的影响以或表示物质在相应时间内对大型蚤生存的影响当浓度间距过近仍不能获得足够数据时可采用使大
8、型蚤活动受抑制或心脏停止跳动的最低浓度和使大型蚤活动受抑制或心脏停止跳动的最高浓度来表示毒性影响的结果检测排水时以百分数或毫升升表示检测化学物质时以毫克升表示试验结果的有效性符合下列条件的试验为结果有效对照组试验未出现不活动大型蚤重铬酸钾的在时为的范围内试验结束时溶解氧浓度必须大于或等于必须经检测证明被测定的试验物质浓度保持于试验全过程至少应为计划配制浓度的如果浓度偏差应以测试浓度结果为准试验报告试验报告要求包括以下几个方面实验蚤的种名来源数目蚤龄饵料驯养时间对照组是否发生死亡被测物质的化学性质来源样品的保存方法保存时间及前处理方法实验用稀释水的性质试验环境水温电导等情况试验条件下大型蚤的任何
9、不正常行为包括中毒症状实验结果数据处理结论讨论方法依据及参考文献附录大型蚤的培养繁殖方法补充件试验蚤的选育试验蚤可以从其他试验室已有的纯培养中挑取引种也可以从野外采集野外采集的蚤要经分离纯化在显微镜下鉴定后选择体大健康的母体数个用小烧杯单个培养选择繁殖量最大的一代为母蚤单克隆化使之成为纯品系饵料雌性的大型蚤可以在生存个月之久蚤类喜食藻类细菌酵母及有机物碎屑等藻类的营养价值高于其他食物本方法推荐用实验室培养的栅藻为大型蚤的饵料栅藻的培养方法见附录容器单个培养母蚤可用小烧杯繁殖培养用大烧杯储备培养用圆玻璃缸或类似大小的水簇箱喂养用不含无机培养剂的栅藻扩大培养液喂养大型蚤可以采用每周次全部更换水蚤培
10、养液的办法也可以每天追加一次浓缩悬浮藻液培养液中栅藻的浓度不宜过高一般在个左右藻液的颜色以淡苹果绿色为宜否则晚间缺氧会引起大型蚤的死亡培养条件氯气对大型蚤生存不利培养用水可选用经自然曝气三天以上的自来水或人工配制的稀释水大型蚤生存的适宜温度为适宜的为大型蚤的密度以每升水中培养个左右母蚤为宜过分拥挤会造成大型蚤停止孤雌生殖大型蚤对氧有较强的适应能力培养液中可保持以上的溶解氧实验蚤的分离大型蚤的生长是间歇性的生长与脱壳交替进行每脱壳一次增加一龄前后脱壳的时间叫龄期性成熟前的龄期为幼龄蚤性成熟后的为成龄蚤大型蚤有个幼龄期幼龄蚤比成龄蚤对毒物更敏感运动受抑制试验一般选用实验室条件下培养代以上的出生的幼
11、蚤最好为同一母体后代采用下述方法可以获得出生后的幼蚤试验前从实验室储备缸中挑取个怀卵母蚤放在一个烧杯中单独培养后取走母蚤幼蚤仍在原繁殖缸中培养时此繁殖缸中的幼蚤即为出生的幼蚤为保证大型蚤的良好繁殖采用下述方法分离母蚤用孔径尼龙网缝制成一个杯形的网袋略小于繁殖缸套在繁殖缸内壁将母蚤放入网内定期提出装有母蚤的尼龙网放入另一个盛有斜生栅藻培养液的培养缸中也可采用使繁殖缸的液体通过上下套合在一起的两个筛网的方法获取试验蚤上层筛网的孔径为下层筛网的孔径为母蚤被阻止在上层粗网上幼蚤被阻止在下层细网上用新鲜斜生栅藻扩大培养液将滤得的水蚤分别冲入繁殖缸内试验期间每天分离一次注明幼蚤的出生日期便得到出生不同时间
12、的幼蚤定期淘汰老母蚤附录斜生栅藻的培养技术补充件斜生栅藻具有较丰富的营养价值实验室实践证明用斜生栅藻喂养大型蚤蚤的生长快个体大繁殖量高保持实验室内斜生栅藻的良好生长是养好大型蚤的关键培养基实验室要经常保持一定数量的斜生栅藻藻种可采用各种适用的培养剂本方法推荐用水生号培养剂培养基成分配如下硫酸铵过磷酸钙饱和液硫酸镁碳酸氢钠氯化钾氯化铁土壤浸出液藻种的培养斜生栅藻可在摇床上振动培养也可在流动通气条件下连续培养最简单的培养方法是用三角瓶装培养液或者用三角瓶装培养液接种藻种使成淡绿色瓶口加松软棉团以防污染温度在光照在连续静止培养可采用日光灯人工光照灯源距离约也可用自然光照避免阳光直射日光照每天摇动次经
13、几天培养后藻液变为深绿色培养好的藻液可做为扩大培养用也可经离心浓缩或自然沉淀浓缩制成浓缩液贮于冰箱备用藻种培养当中要经常镜检检查是否有杂藻纤毛虫和轮虫藻种要经常转接以防止老化转接的时间视藻种生长的情况而定一般每周次藻液发深绿色即要转接老化藻在显微镜下可明显见到聚集成团的藻群色素变黄摇动振荡后仍出现大量沉淀斜生栅藻的扩大培养为获得培养大型蚤的足够饵料可在实验室内进行斜生栅藻的扩大培养扩大培养采用的圆玻璃缸或类似大小的水蔟箱在玻璃缸中加入培养好的栅藻液用经自然曝气的自来水稀释成淡绿色扩大培养中不加任何营养盐可放置条斑马鱼其他不食斜生栅藻的鱼也可每天照旧投鱼饵鱼可以起搅拌作用其排泄物也有利于栅藻的生
14、长扩大培养的栅藻液可直接喂大型蚤附录废水或一种物质储备液浓度为对大型蚤运动受抑制测定实例补充件预试验结果每个浓度个大型蚤表浓度活动的大型蚤数目正式试验的浓度范围为正式试验试验结果的试验结果如表表浓度百分浓度浓度对数值活动的大型蚤个数不活动大型蚤百分比概率值计算采用概率单位图解法见图是对排放废水这可表示为或对储备液浓度为的化学物质此结果可表示为概率单位图解法的计算程序如下将浓度换算成浓度对数值作为横坐标不活动蚤百分数换成概率值作为纵坐标在算术坐标纸上绘图若用对数概率纸可不必进行上述换算直接作图由于概率单位尺度达不到和作图时若是需要这样的数值可以使用箭头表示这些点的真正位置顺着各点的分布趋势用直尺作出一条最接近各点的直线作直线时应多照顾靠近概率单位为处的各点从纵轴概率单位为处引一水平线与直线相交再从交点作垂线与横轴相交即可读出的对数值此值的反对数即是用目测法求得的值的计算方法相同计算机计算或及置信限程序采用语言将寇式修正法公式输入型便携式计算机或其他类型计算机进行操作寇式修正法公式式中最大对数剂量相邻两组对数量之差数各组死亡率组号图附加说明本标准由国家环境保护局科技标准司提出本标准由北京市环境监测中心北京市环境保护研究所负责起草本标准主要起草人谢凤君乔佩文向琍云邹文梅本标准由国家环境保护局负责解释
