1、中华人民共和国国家标准水质物质对淡水鱼斑马鱼急性毒性测定方法发布实施国家技术监督局国家环境保护局发布中华人民共和国国家标准水质物质对淡水鱼斑马鱼急性毒性测定方法国家环境保护局批准实施本标准参照采用国际标准水质物质对淡水鱼斑马鱼急性致死毒性的测定本标准可根据被测物质的性质确定采用静水式换水式或流水式试验推荐采用斑马鱼并不排除使用其他鱼种但对试验条件需做相应的改变例如稀释水性质及温度除斑马鱼外在不改变本标准的试验条件下青鱼真骨鱼总目青科亦可供使用本标准使用重铬酸钾为参考毒物在试验期间重铬酸钾的值必须处于之间主题内容与适用范围本标准规定了在确定的试验条件下测定水溶性物质引起斑马鱼急性致死毒性大致范围
2、的方法静水法换水法和流水法本标准适用于水中单一化学物质的毒性测定工业废水的毒性测定也可使用此方法废水样品的采集保存干扰的处理见附录原理在确定的试验条件下用斑马鱼为试验生物测定毒物在或后引起受试斑马鱼群体中鱼致死的浓度这个浓度以或表示定义静水式试验试验期间不需更换试验液限于研究那些化学性质比较稳定的物质换水式试验每或更短的时间内更新一次试验液可用于试验这类物质它们的浓度在更换试验液的时间内相对稳定亦即波动在初始值的之内流水式试验试验液连续更新可用于大多数物质包括水中不稳定的物质试验生物和试验溶液的制备试验生物试验鱼种应是斑马担尼鱼真骨鱼总目鲤科试验鱼体长体重选自同一驯养池中规格大小一致的幼鱼试验
3、前该鱼群应在与试验时相同的环境条件下在连续曝气的水中至少驯养两周试验前停止喂饲每天清除粪便及食物残渣驯养期间死亡率不得超过如果超过则该批鱼不得用作试验试验鱼应无明显的疾病和肉眼可见的畸形试验前两周内不应对其做疾病处理斑马鱼驯养繁殖的环境参数见附录标准稀释水新配制的标准稀释水为硬度为左右以计用蒸馏水或去离子水由下面种溶液制备氯化钙溶液将氯化钙溶于水中并稀释至硫酸镁溶液将硫酸镁溶于水中并稀释至碳酸氢钠溶液将碳酸氢钠溶于水中并稀释至氯化钾溶液将氯化钾溶于水中并稀释至将以上四种溶液各取加以混合并用蒸馏水稀释至将制备好的稀释水曝气至溶解氧浓度达到空气饱和值并将稳定在如果需要用氢氧化钠溶液或盐酸调节这样制
4、备的稀释水试验前不需强制曝气制备试验物质储备液配制试验物质储备液所用试剂至少为分析纯将已知量的试验物质溶于一定体积稀释水去离子水或蒸馏水中储备液应当天配制对于化学性质较稳定的物质可配制供两天以上使用的溶液配好后低温保存溶解低溶解度的物质时可使用超声波装置也可加入对鱼低毒的有机溶剂有机溶剂在试验溶液中的浓度不应超过并应同时进行两组对照试验一组含有的溶剂为全部试验溶液中的最高浓度另一组则不含溶剂或试验物质试验溶液的配制及浓度的选择向稀释水中加入适当的试验物质储备液使达到所需要的浓度配制试验溶液时按几何级数间距选择浓度如等在测定废水样品时可以百分比体积浓度按几何级数间距选择浓度仪器设备试验容器用玻璃
5、或其他化学惰性物质制成应不明显吸附试验物质常用设备尼龙或其他软惰性材料制成的抄网应专网专用试验容器静水式换水式试验所用的容器应有足够大的容积水量一般以鱼的负荷克鱼升水计算试验介质与空气间有足够大的界面每介质要有大约的介面积并备有牢固的密封盖流水式试验的容器可用多颈的圆底玻璃烧瓶容积带有磨口的玻璃接口见图或用类似的玻璃仪器使用多颈圆底烧瓶时一个颈上安有标准进口管第二个安出口管的颈上应装一个粗孔过滤器初次使用的试验容器用前应仔细清洗试验后倒空容器以适当的手段清洗用水冲去痕量试验物质及清洗剂干燥后备用试验容器临用前用稀释水冲洗图流水法所用仪器举例磨口玻璃接口试验液入口试验液出口磨口玻璃接口粗孔过滤塑
6、料支撑环控温设备用适宜的方法将试验溶液和蓄养池中的水温调节在试验条件采用标准稀释水为试验用水试验溶液的配备与储存鱼的管理及全部操作和试验都应在空气污染物未达到有害浓度的大气中进行为避免对试验鱼不必要的扰动试验液中溶解氧不少于每天光照保持试验期间水温恒定在试验前停止给试验鱼喂食整个试验期间亦不喂食可酌情选择纯化学化合物如重铬酸钾为参考毒物可根据需要进行多次参考毒物的毒性试验以得到参考毒物试验数据重现性的资料每当蓄养种群发生变化都应按本方法规定的条件重复进行试验这些试验结果应与同一实验室早先测得的结果一致试验步骤预备试验预备试验用于确定试验浓度的大致范围这一范围一般可以以为公比做间隔例如和向六个容
7、器中均加入标准稀释水如果需要进行曝气使溶解氧浓度恢复到空气饱和值向其中五个容器中加入适量的试验物质储备液配制一组适宜的浓度系列第六个容器用做对照如果数据不充分无法确定正式试验所需要的浓度范围则另选一个浓度范围进行试验将溶液在恒温试验时间为向每个容器放五尾鱼每天至少记录两次每个容器中的死鱼数目及溶解氧浓度并及时将死鱼取出如果采用流水式试验则应用流水法做预备试验测定废水样品时应当首先测定废水样品的溶解氧含量并了解废水的大致性质只有废水含有适量的溶解氧时才能不经稀释进行毒性试验正式试验从预备试验中杀死全部鱼的最低浓度与未毒死鱼的最高浓度之间以几何级数做间距至少选择个浓度为正式实验的浓度其浓度范围在三
8、个依次的几何系列浓度中最好能够测得到的死亡率以估计值至少取个容器流水式试验用个的烧瓶与辅助设备连好均加入标准稀释水其中一个为空白试验即对照试验其余容器中加入不同量的储备溶液以得到所要求的浓度范围如果用有机溶剂溶解物质则需配制第二个对照溶液使标准稀释水中有机溶剂的浓度与试验液中有机溶剂的最高浓度相当将试验液温度恒定在按下述方法向每个容器中放入尾或更多的试验鱼用尼龙或其他软惰性材料编织的小孔抄网从驯养鱼群中随机选取鱼放入试验容器中取要迅速在鱼转移过程中因操作不慎掉下的鱼或其他操作不善的鱼弃去不用所有的鱼需在内转移完毕使用换水式试验时更新一次试验液视试验物质的性质溶解氧等具体情况而定立即将试验鱼转移
9、到其中去转移时从最低浓度开始依次向高浓度过渡避免因使用抄网造成的各容器间试验物质的明显转移流水式试验时启动流水装置更新溶液的速率至少为如果出口溶液的溶解氧浓度能维持大于则更新速率可以低到可连续更新也可在短时间内间歇更新用于更新的试液的温度需控制在鱼转移的方法同随时观察并记录试验鱼的平衡游动呼吸体色变化等中毒症状试验开始后内要特别注意观察每天至少记录两次每个容器中的死鱼数目用玻璃棒轻触鱼的尾部没有反应即认为已死亡及时清出死鱼对照组的死亡率不得超过对照组试验期间鱼的外表及行为不正常或病态鱼也不得超过否则要重新进行试验试验开始和试验结束时测定试验液及储备液中被测物质的浓度每天至少测定一次各试验液的溶
10、解氧和温度试验开始和结束时亦要测定斑马鱼急性毒性观察记录表格见附录结果的表述直线内插法估算用简单的图示法估算时可绘制死亡百分率对试验物质浓度的曲线采用线性刻度的坐标轴时是一条形的关系曲线从引起死亡率的内插浓度值得到值见图图直线内插法估算概率单位图解法估算将试验浓度下观察到的鱼的死亡数列表要计算和值但一般以或表示结果以浓度对数作为横坐标死亡概率为纵坐标在算术坐标纸上绘图百分率与概率单位换算表见附录由于概率单位尺度达不到和作图时若是需要这样的数值可使用箭头以表示这些点的真正位置其次用目测法画一条直线使它拟合图中的数据点要特别考虑和死亡率之间的数据点即死亡概率和之间的点力求减少这些点与直线间垂直偏离
11、的总和如果无法确定如何安排这条直线可以尽量将它画向水平方向因为这样便承认了数据中较大的变异性从定出的直线读出致死的浓度对数从而估算出例如图中的浓度及百分死亡率可换算成如下数后在算术坐标上绘图见图浓度浓度对数死亡百分比死亡概率图概率单位图解估算如果需要估算曲线斜率及其置信限可用图解法对试验结果进行分析例如图解法也可以使用计算机采用概率单位分析如果没有足够的数据用于估算和下的值则应记录在和下试验鱼全部死亡的最低浓度和全部存活的最高浓度这些浓度会指明的大致范围试验报告在试验报告中要求列出下列资料及数据试验条件静水式换水式或流水式控温及曝气情况与试验有关的化学生物和物理数据包括驯养鱼的详细情况及每升水
12、中的载鱼克数配制稀释水储备液和试验液的方法试验用水特性硬度溶解氧等列表绘出试验液的浓度或化学分析值以及试验开始后和下的值若可能列出其置信限给出参照采用的计算方法及所用的化学分析方法对照鱼的死亡率行为反应异常的比例参比物质的值鱼的中毒反应症状附录废水样品的采集和处理补充件样品的采集应对水样的代表性有充分的估计在了解了生产流程及废水排放的情况下采集有代表性的样品工业或其他废水样品成分如不稳定应在不同时间采集不应合并水样如果废水的组成和毒性变化很大必须测定可能是最毒时间所采集的样品求其最大毒性样品的保存工业或其他废水样品应取满瓶塞紧贮存在不超过原水样温度同时温度又比较稳定的地点如果水样中含有易被细菌
13、分解的物质则应将水样贮于冰箱中并尽量缩短水样在试验前的保存时间水样缺氧的处理办法应区别鱼类在污染水体中由于缺乏溶解氧引起的死亡与中毒而引起的死亡许多工业废水具有较高的化学需氧量或生化需氧量造成水样缺氧在此种情况下可用三种方法以保持水样有足够的溶解氧试验溶液的人工曝气采用适当的装置使试验液人工氧化而又避免失散挥发性物质例如可采用密闭的容器将玻璃导管从容器的顶部一直插到接近容器的底部用适当的压力控制设备以恒定的速度引入压缩空气或氧气保持适当的样品含量避免过饱和此外也可采用部分充满溶液的较大容器内静表面保持一个富氧气压的办法切忌用压缩空气剧烈曝气稀释水的最初充氧工业废水可能不含氧也可能有较大的瞬时耗
14、氧需使每一水样在试验前有足够的溶解氧在稀释水与废水混合前将稀释水充氧可事先测定废水的含氧量和瞬时耗氧量对于许多具有高耗氧量的工业废水用这种方法不能得到足够的溶解氧可采用所叙述的方法试验报告中要说明是在水样充氧的情况下取得的及时更换试验液的办法也可使水样维持适量的溶解氧使用恒流装置流水式试验可以保持水样中含有适量的溶解氧鉴于目前一般的实验室还不能普遍使用恒流系统设备每或周期性更换试验溶液也常可得到满意的结果干扰如果被测定物质的废水具有很大的挥发性不稳定性会造成试验结果的偏差对于这种情况可采用流水式试验以取得更可靠的试验结果此外要充分重视废水水样的变化引起的毒性变化可先对原水进行试验取得一定数据后
15、再把水样的调解到正常范围内进行正式试验附录斑马鱼驯养繁殖的环境参数补充件引言斑马鱼起源于印度的科罗曼德尔海岸生活在急流中最近考察了斑马鱼的生态学有关它们管理和养殖资料可从热带鱼养殖的标准参考书中查出斑马鱼体长很少超过鱼体呈圆柱形在银白色的鱼体上有条深蓝色水平条纹这些条纹延伸至尾鳍和臀鳍背部呈橄缆绿色雄性较雌性少带有金黄色光泽雌性更偏呈银白色产卵前腹部特别膨胀环境参数斑马鱼可以忍受较宽的温度酸碱度及水的硬度驯养时通常为中性水温维持在诱导产卵时控制在水温在总硬度高达以计斑马鱼仍能正常生活材料和方法容积以上的玻璃容器均可作产卵箱由于成鱼贪吃鱼卵故需要有保护鱼卵和幼鱼的方法一种行之有效的方法是在距产卵
16、箱底部处设一挡板板上开孔孔眼直径约将成鱼限制在挡板上当雌鱼产卵时卵通过板孔落入箱底而成鱼不能到达此区产卵时的处理方法成熟后的雌雄鱼应分开饲养产前停止喂养将新鲜自来水放置或经曝气后的蒸馏水注入产卵箱内于晚间将雌雄鱼各放入产卵箱中产卵箱内温度控制在一般于次日产卵大约产卵完毕雌鱼每次产卵约粒个体大者可达千粒此时将成鱼取走留下卵待孵化鱼苗的发育鱼卵天孵化完鱼苗附着在箱壁上在内不动当鱼苗能自由游动时用原生动物或特制的小颗粒鱼食喂饲周后用新孵化的丰年虫无节幼体喂鱼苗一个月后转移到容积两百升的水族箱内喂以活的或特制的饲料三个月后鱼性成熟体长达左右文献目录GB/T 13267-1991 (B5) NIIMI,
17、 A. J. and LAHAM , Q. N. inf1uence of breeding time interval on egg number , mortality and hatching of the zebra fish CBrachydanio rerio). Can. J. Zool. 521974 515-517。(B6) PIRON ,R. D. Spontaneous skeletal deformities in the zebra fish CBrachydanio rerio)bred for fish toxicity tests. J. Fish Biol. 13 1978 , 79-840 9 附录斑马鱼急性毒性观察记录补充件实验室操作者样品编号试验开始日期试验物质分子式纯度其他资料储备液配制方法储备液浓度试验容器中最大溶剂浓度本试验采取的分析方法时间项目对照浓度浓度浓度浓度浓度死亡数水温溶解氧中毒症状死亡数水温溶解氧中毒症状死亡数水温溶解氧中毒症状死亡数水温溶解氧中毒症状附录百分率与概率单位换算表附录为本标准附件百分率概率机率百分率概率机率续表百分率概率机率百分率概率机率附加说明本标准由国家环境保护局科技标准司提出本标准由北京市环境保护监测中心负责起草本标准主要起草人谢凤君陈惠志赵幼一本标准由国家环境保护局负责解释
