1、前言GBjT 18932的本部分的附录A为资料性附录。本部分由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位:中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本部分主要起草人:庞国芳、付宝莲、张进杰、肖艳霞。本部分系首次发布的国家标准。GB/T 18932.21-2003 1 范围蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法酶联免瘦法GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中氯霉素残留量酶联免疫测定方法。本部分适用于蜂蜜中氯霉素残留量的测定。本部分的方法检出限.氯霉素为0.30g/kg。2 规范性引用文件GB/T 18932.21-2003 下列文件中的条款通过GB/T1893
2、2的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性CGB/T 6379-1986 ,neq SO 5725 ,1 98 1) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法CGB/T6682-1992 , neq SO 3696 ,1 987) 3 原理试样中残留的氯霉素与试剂盒中的氯霉素酶标记物共同竞争氯霉素抗体，形成有
3、腾标记或无酶标记的抗原抗体复合物而被吸附于微孔板底。用酶标仪在450nm处测定吸光度，根据吸光度值得出样品中氯霉芳的残留量。4 试剂和材料4.1 氯霉素试剂盒4. 1. 1 96孔板，12条X8孔。4. 1. 2 氯霉素标准溶液。4. 1. 3 氯霉素酶标记物溶液。4. 1. 4 氯霉素抗体溶液。4. 1. 5 酶基质。4. 1. 6 发色剂。4. 1. 7 反应停止液。4. 1. 8 缓冲溶液。4.2 乙酸乙醋分析纯，重蒸馅。4.3水GB/T 6682规定的级水。5 仪器5.1 酶标仪。GB/T 18932.21-2003 5.2 洗板机z配8道或12道洗头。5.3 8道移液器，50L300
4、Lo5.4 单道移液器，5L50L，100L1000L和2mL10 mL。5.5 离心机。5.6 氮气吹干仪。5.7 10 mL具塞试管。5.8 液体混匀器。5.9 振荡器。6 试样制备与保存6.1 试样的审j备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的实验室样品，在密闭的情况下，置于不超过60C的水浴中温热、振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温e分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。自.2试样的保存将样品于室温下保存。7 分析步骤7.1 提取称取2g试样，精确到0.01g，置于25mL具塞离心管中，加入4mL水和4mL乙酸乙酶(4.2)，在液体混匀器上充分
5、混匀2min，使试样完全溶解。在振荡器上振荡10min，以4000r/min离心10mino 准确吸取上层乙酸乙酷1mL于10mL具塞试管(5.7)中，用氮气吹干仪在500C吹干。加入0.5mL缓冲溶液(4.1.8)溶解残渣，供酶标仪测定。此溶液含试样量0.5g，稀释系数为107.2 测定条件以下所有操作应在20C240C室温下进行D7.2.1 酶标仪测定条件:酶标仪测定波长为450nmo 7.2.2 洗板条件如下7.2.2.1 洗板机洗板条件:采用条式抽干和注满，洗涤次数八次，每次注水量为250L350L 7.2.2.2 人工洗板条件洗涤次数五次以上，每次注水量为250Lo7.2.3 氯霉素
6、试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温(200C240C)后方可使用。氯霉素标准溶液(4.1.2)、氯霉素酶标记物溶液(4.1.3)和氯霉素抗体溶液(4.1. 4)等均按1份试剂+10份缓冲溶液进行稀释与制备】。每次测定所用的稀释液均应现配现用。7.2.4 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准及样品等在微孔架上的位置(模板图)。7.3 测定测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。7.3. 1 分别吸取50L稀释的酶标记物、氯霉素标准溶液、样品溶液和氯霉素抗体2)等按模板图位置，依次加入各自的微孔底部，然后，用封口膜密封孔条以防溶液挥发。持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20C
7、240C避光孵育2h3)。1) 个别品牌试剂盒中试剂的稀释革数略有不同。2) 个别品牌试剂盒中的试剂加人量略有不同。3) 个别晶牌试剂盒的孵青温度与时间略有不同。GB/T 18932.21-2003 7.3.2 将微孔架置于洗板机上，按设定的洗板程序洗板后，将微孔架反扣在吸水纸上并反复拍打。此步骤既要去除微孔中过多的残液，又不能使微孔子燥。7.3.3 迅速加人50L酶基质和50L发色JliJ于微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于20C24 c避光孵育30min. 7.3.4 迅速加入100L反应停止液于微孔底部。然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪
8、中，在450nm处测量吸光度(加入反应停止液后应在60min内读取吸光度)。7.4 平行试验按以上步骤，对同一标准、同一样品溶液均应进行平行试验测定。7.5 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。7.6 监控试验每次测定均应做一个添加氯霉素标准的样品。8 结果计算在半对数坐标纸上，以吸光度值为纵坐标(%).氯霉素标准溶液浓度(g/kg)为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氯霉素浓度后，结果按式(1)计算:式中.x c. :000 = c. -一m 1000 X 试样中氯霉素残留量，单位为微克每千克(g/kg), c 从标准工作曲线上得到的试样中氯霉素浓度，单位为纳克
9、每毫升(ng/mL), V 样品溶液的最终定容体积，单位为毫升(mL)，m一-样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克(g)。结果表示到小数点后两位。注z计算结果应扣除空白值。9 确证试验如被测样品中氯霉素残留量的值大于检出限时，应用GC-MS法或LC-MS-MS法进行确证。10 精密度.( 1) 本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。10.1 重复性在重复性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.300吨/kg4.050g/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(叶，本部分的重复性限按方程式(2)计算zr 0.049 7
10、 m十6.649 5 .( 2 ) 式中m 两次测定值的平均值，单位为微克每千克(g/kg)。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。10.2 再现性的个别品牌试剂盒中的酶基质和发色剂合二为-加入量也略有不同。GB/T 18932.21-2003 在再现性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.300g/kg-0.50g/kg范围时，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性(阳，本部分的再现性限按方程式(3)计算:19R 0.957 2 19m - O. 837 4 ( 3 ) 式中:m 两次测定值的平均值，单位为微克每千克(Ig/kg)。附录A(资料性附录)回收率本方法中氯霉素添加浓度及回收率的试验数据z在添加最为0.300flg/kg时，平均回收率为98.1%, 在添加量为1.350g/同时，平均回收率为104.7%，在添加量为2.500g/kg时，平均回收率为101.0% , 在添加量为4.050g/kg时，平均回收率为86.9%。GB/T 18932.21-2003
