1、ICS 67. 180. 10 X 31 华.留王G/T 18932.9 2002 Method for the determination of penicillin residues in honey一Cylinder plate method 2002-12-30发布中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局2003-06-01实发布前GB/T 18932一2002分为12个部分，本部分为第9部分，GB/T 18932的本部分遵循GB/T20001. 4-2001标准编写规则写规则.本部分的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录.本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.本部分由中
2、华全国供销合作总社归口.本部分起草单位z中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本部分主要起草人z庞国芳、付宝莲、林忠.本部分系首次发布的国家标准.G/T 18932.9-2002 第4部分z化学分析方法的编G/T 18932.9-2002 2 范固蜂蜜中青毒素残留杯碟的测定方法法GB/T 18932的本部分规定了蜂蜜中青霉素残留量的杯碟测定方法.本部分适用于各种蜂蜜中青霉素残留量的测定。本部分青霉素的方法检出限为0.025mg/kg, 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不运
3、用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.GB/T 6379-1986 (neq ISO 5725: 198 1) 测试方法的精密度通过实验室问试验确定标准测试方法的重复性和再现性GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法(neqIS0 3696: 1987) 3 原理试样中残留的青笃素经用磷酸盐缓冲液溶解、离心后，取上m液作杯碟法测定，并用标准曲线进行定量.青霉素部作确证试验。4 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682一1992中规定的三级水.4. 1 试验菌种藤黄
4、微球茵(MicrococcusLuteus) 0菌种号(ChinaMicrobial Culture Collection)CMCC(B)28001 , 4.2 标准物质青霉素钩，1663 IU/mg戎相当者.4.3 青霉素酶伊内殷殷酶4.4 工作液的配制4.4. 1 磷酸盐缓冲溶液:pH6.0，称取8.0g元水磷酸二氢何，2.0g元水磷股氢二饵.溶解于水中并定容至1000 mL, 4.4.2 生理盐水:8.5g/L，称取8.5g氯化销，溶解于1000mL水中，121c高压灭菌20min, 4.5 标准溶渡的配制4.5. 1 青霉素标准储备溶液g准确称取(精确至O.1 mg)青霉素标准物质(4
5、.幻，用磷酸盐级冲击3液(4.4.1)溶解并定容为1000g/mU按效价换算的标准储备溶液.当天配制，当天使用.4.5.2 青霉素标准工作溶液2取标准储备溶液(4.5.1)用磷酸盐缓冲击军液稀释，配制浓度为0.20、O. 10、0.05、0.025和0.0125g/mL的标准工作溶液.当天配制，当天使用.1 L一-_ GB/T 18932.9-2002 4.6 4. 6. 1 4.2 4.7 培养基fE养基lz见第A.1草。j-;.养基2见寄自A.2章。菌悬渡的制备将试验两种(4.1)接种于培养基2(4.6.2)内，经(35士1)C培养18h-24儿取适量培养液转种于fR养基1(4.6.1)斜
6、面上.经(35土1)C培养18h-24 h.用10mL生理盐水(4.4.2)洗下菌苔即为菌悬液。4C Jf: f7 .贮存期限2周。5 5. 1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5. 7 仪器均质232转速不低于5000 r/min. 离心机:转速不低于4000 r/min. 生化培养箱:(35士1)C。高压灭菌器.培养皿g内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。牛津杯:不锈钢小管.外径(8.0土0.1)mm.内径(6.0土0.1)mm.高度00.0士O.1) mm. 游标卡尺=测量范围omm-200 mm.将度土0.02mm. 6 试样的制备与保存6. 1 样品的制备将
7、样品搅拌均匀.分出0.5kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。6.2 试样的保存将样品于常温下保存.7 测定步骤7. 1 提取称取10g试样，精确至0.01g.置于50mL离心管中。加入20mL磷酸盐缓冲溶液(4.4.1)搅匀，静咒10mino用均质器均质1min(4 000 r/min)后离心30min(4 000 r/min).移取全部上清液到20 mL具家试管中并用磷酸盐缓冲溶液定容至刻度.此在5液含试样量为0.5g/mL. 7.2 测定7. 2. 1 茵悬液用量的测定在实际测定前，将不同浓度的菌悬液(4.7)加入定量的培养基1(4. 6. 1)中培养，能使O. 01
8、2 5g/mL浓度的青霉素标准工作溶液产生直径大于10mm、清晰、完整的抑菌图为最适菌悬液用!l1:.7.2.2 检定用平板的制备将从7.2. 1所得的最适菌悬液用量加人已洛化并拎至48C-50C左右的培养基1(4.6.1)中，充分混匀并立即倾注在灭菌培养皿中，每平皿加入量为9.0mL.置水平台上凝固后，在每个检定用平板中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8cm的困面成60角间距.所用平板应当天制备.7.2.3 标准曲线的制备青霉素标准工作溶液(4.5.2)0.20、O.10、0.05、0.025和0.0125g/mL五个浓度中.O. 05g/mL 标准工作榕液为参考浓度.每个青霉素标准
9、工作溶液(4.5.2)浓度除参考浓度(0.05g/mL)外，各取三个检定用平板(7.2.2)为一组，四组共12个检定用平板.每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度(0.05g/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作溶液.这样参考浓度(0.05g/mLl标准2 j 一一一 一一一G/T 18932.9-2002 工作浓浓将得出36个抑菌图直径i主数的数据.其他浓度标准工作活液将各得九个抑菌图直径读数的数据。盖好陶瓦盖.置(35+ l) ctll养18h土1h后取出，翻转平板.除去牛tJt杯，执游标卡尺准确地扭H1:各抑菌固直径(fi确到0，1 mm)，求出各组平板中标
10、准工作溶液浓度及参考浓度(0.05g/mL)，抑菌图直径读数的平均值以及参考浓度(0.05g/mU，36个抑茵图直径读数的总平均值。用参考浓度(0.05g/mL)的总平均值减去各组参考浓度(0.05g/mL)的平均值之差为校正值，以此但校正其他各浓度标准工作浴液及被测样品在于液抑茵图直径读数的平均值.将各组校正值代人式(1)和式(2)中.求出L和H值.在半对数坐标上.以抑茵图直径(mm)为纵坐标(算术级)，以标准工作溶液浓度(g/mL)为横坐标(对数级)，标出L和H点，连一直线，即为标准曲线.L = (3a+2b+c-e)/5 H = (3e+2d+c-a)/5 式中zL一一标准曲线上最低浓度
11、(0.0125g/mL)的抑菌图直径，单位为毫米(mm).H一一标准曲线上最高浓度(0.20g/mL)的抑茵图直径，单位为毫米(mm).C一一参考浓度(0.05g/mL)抑茵图直径的总平均值，单位为毫米(mm).( 1 ) . ( 2 ) a，b、d、一分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作洛液(0.0125、0.025、0.10、0.20g/mL)抑菌图直径数据的校正值，单位为毫米(mm7.2.4 样品溶渡的测定每份样品溶液需三个检定用平板(7.2.2).按7，2. 3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛津杯中注满参考浓度(0.05g/mL)标准工作荒草液，另三个牛津杯中则注满被测样
12、品m液.将肉瓦盖盖好，(35士I)C培养18h土1h后，翻转平板，除去牛洋杯，执游标卡尺准确地测量抑茵阻直径(精确到0.1mm)，分别求出被测样品溶液及参考浓度抑茵图直径i主数的平均值.7.3 确证试验如被测样品溶液抑图茵直径读数的平均值二lOmm时，应做确证试验.取青霉素酶(4.3)并按产品说明稀释.将此稀释溶液按比例加到样品溶液中0+19)，(35士1)C培养30min.取三个检定用平板，按7.2. 3标准曲线制备的要求放置牛津杯.各平板中的两个牛津杯中注满参考浓度(0.05g/mL)标准工作榕液，另两个牛津杯中注满未加酶处理的样品溶液，最后两个牛津杯中则注满经酶处理的样品溶液.将向瓦盖盖
13、好，(35土1)C培养18h士1h后，如经酶处理过的样品溶液无抑菌图形成，而未经酶处理的样品洛液仍有抑菌图形成，说明样品洛液中的抑茵物质确为青霉素.本方法的添加回收率数据参见附录LE 结果计算如被测样品溶液抑茵图直径i主数的平均值10mm，即报告为未检出.如被测样品帮液抑菌图直径读数的平均值二:10mm，按7.2.3要求校王后，从标准曲线上查出相应的青霉素含量同/mL)，再乘以样品的稀释系数2，即得出以g/mL计的青霉素含量，根据确证试验(7.3)报告结果.如果样品中青霉素的含量单位用mg/kg表示时，可将g/mL按式(3)进行换算.式中gX z EH. .( 3 ) m x一一样品搭液中青霉
14、素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg), 3 G/T 18932.9-2002 9 C一一从标准的1线上查出的样品吁:液中相应的背霉素含量，单位为微克每毫升(g/mU;m一占1终样品济液中所代表的样品量，单位为克每毫升(g/mU。精密度GIl/T 18932的本部分析密度数据是按照GIl/T6379一1986的规定，通过九个实验室对四个添加水平的试样所做的试验中确定的.获得重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算.9. 1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(忡，本部分方法的重复性限按方程式(4)计算z蜂蜜中IY霉素的含量在0.025mg/kg-O. 20
15、0 mg/kg范围zIgr = 0.8398 Igm - 1. 1629 .( 4 ) 式中:m一一两次测定值的平均缸，单位为毫克每千克(mg/kg) 如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)本部分方法再现性限按方程式(5)计算z蜂蜜中青霉素的含量在0.025mg/kg-O. 200 mg/kg范围IgR = O. 808 6m - O. 862 5 . ( 5 ) 式中zm一一两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg).4 A. 1 培养基1蛋白陈10.0 g 牛肉膏3.0 g
16、 氯化钊5.0 g 附录A 规范性附录l培养基琼脂15 g20日蒸馆水1 000 mL G/T 18932.9-2002 将上述各成分于蒸f宙水中加热溶解.用1mol/L氢氧化纳溶液或(10+90)的盐酸调节pH.佼其灭茵后pH为7.3士O.1，分装于三角瓶内，于121C高压灭茵15mino A.2 培养基2蛋白陈10.0 g 牛肉膏3.0 g 氯化纳5.0 g 蒸馆水1 000 mL 将上述各成分于蒸恼水中加热溶解，用1mol/L氢氧化纳溶液或(10+90)的盐酸调节pH.使其灭茵后pH为7.3士0.1.分装于大试管中，每管约10mL.于121C高压灭茵15mino 5 G/T 18932.
17、9-2002 6 附录B资料性附录回收率本方法中青霉素添加浓度及回收率的试验数据.在添加量为0.025mg/kg时，平均回收率为93.6 % ; 在添加最为0.050mg/kg时，平均由收率为80.8 % ; 在添加是为O.100 mg/kg时，平均回收率为83.1 %; 在添加量为O.200 mg/kg at ，平均回收率为86.7 %. NOON m.Nmm-共国家标准蜂密中青霉素残留量的测定方法杯礁法Gll!T 18932.9-2002 同囚。国和民人华中 中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码，100045电话，68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售68517548 印张3/4字数13千字2003年3月第一次印刷1/16 2003年3月第一版印数1-400开本880X 1230 书号，155066.1-19301 网址版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533
