1、ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 189362003 高致病性禽流感诊断技术Diagnostic techniques for highly pathogenic avian influenza 2003-01一10发布中华国家质人民共和国督检验检菇总局2003-05-01实施发布253 GBjT 18936-2003 前言高致病性禽流感(highlypathogenic avian influenza，简称HPAI)是由正教病毒科流感病毒属中的A型流感病毒引起的，被世界动物卫生组织WorldOrganization for Anim口I丑lalHealth (
2、英).沃.0)ff仕1陀ceInter nat 本标准是参考OIE凹诊断试验和疫苗标准手册以(2000年版)并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准的附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准起草人.唐秀英、李海燕、田国斌。254 GB/T 18936-2003 高致病性禽流感诊断技术1 范围本标准规定了高致病性禽流感(HPAD病毒分离与鉴定技术、血凝(HAJ和血凝拇制(HIl试验、琼1旨凝胶免疫扩散(A
3、GIDJ试验、酶联免疫吸附试验(间接ELISAJ的技术要求。本标准所规定的高致病性禽流感病毒分离与鉴定技术适用于各种禽类高致病性禽流感的病原分离和鉴定，AGID和间接ELISA适用于A型禽流感病毒的型特异性检验sHAHI试验适用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定。2 病毒分离和鉴定技术2. 1 材料准备2. 1 1 病料的采集死禽采集气管、僻、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理;活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是以采集气管拭子更好，小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。2. 1. 2 病料的保存病料应放在含有抗菌素的pH值7.07. 4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内(无PB
4、S可用25%50%的甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素(2 000 IU/mU、链霉素(2mg/mLl、庆大霉素(50g/mU和制霉菌素(1000 IU/mU.但粪便利泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7.07.4。在室温放置1h2 h后样品应尽快处理，没有条件的可在4C存放几天，也可于低温条件下保存(-70C贮存最好)。2 .3 病料的处理=将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子g粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.07， 4的等渗PBS溶液配成10%20%(g/mU的悬液。样品液经1000 r/min离心10min，取上清液作为
5、接种材料。2.2 病毒分离2 2. , 样品接种g取处理好的样品，以0.2mL/胚的量经尿囊腔途径接种9日龄11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个庭，于35C37C孵化箱内孵育.18h后每8h观察鸡胚死亡情况。2.2.2 病毒收获无菌收取18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应说明可能布正教病毒科的流感病毒;若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性。2. 3 病毒鉴定2. 3. 1 A型流感病毒的型特异性鉴定z样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性鸡脏的绒毛尿囊膜(CAMJ制成抗原，与A型禽流感病毒标准阳性血清进
6、行AGID试验，检测样品中是否含有A型流感病毒。2.3. 1. 抗原制备z从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2的PBS冲洗后，将CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反复冻融3次4次，以1000 r/min离心10min后取上清，按终浓度为0, 1 %的量加入甲隆溶液。置37C温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原.用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中含有A型禽流感病毒。2. 3. 1. 2 AGID试验方法2按本标准第4章中的方法进行。2.3.2 血凝素亚型鉴定2当鸡胚尿囊液具有血凝活性时，首先应排除血凝活性是否
7、由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。鸡胚尿囊液具有血凝活性或证明255 GB/T 18936-2003 含有A型流感病毒在在后，采用日A-HI试验方法(按本标第3章中的方法进行)，用禽流感病毒15种血凝素(HlH15)亚型分裂血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。2.4 致病性测定禽流感病毒致病性测定应在具有高度生物安全性的实验室中进行，有以下两种方法，任选其-02 4. 1 静脉接种致病指数(IVPIl测定法2. 4. 1. 1 试验鸡z6周龄SPF鸡，10只。2.4.1.2 接种
8、材料g感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。2. 4. 1. 3 接种方法:将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1, 10稀释，以0.1mL/羽的剂量翅静脉接种。2. 4. 1. 4 每日观察每只鸡的发病及死亡情况，连续观察10d，计算IVPI值。计算方法参见附录Ao2. 4. 1. 5 判定标准:当IVPI值大于1.2时，判定此分离株为高致病性禽流感CHPAD病毒株。2. 4. 2 致死比例测定法2. 4 2. 1 试验鸡4周龄8周龄SPF鸡，8只。2.4.2.2 接种材料感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。2.4.2.3 接种方法将感染鸡
9、胚尿囊液用生理盐水1 10稀释，以0.2mL!羽的剂量翅静脉接种。每日观察鸡的死亡情况，连续观察10d。2.4.2.4 判定方法2. 4. 2. 4. 1 接种10d内，能导致6只7只或8只鸡死亡，判定该毒株为高致病性禽流感病毒株。2.4.2.4.2 分离物能使1只5只鸡致死，但病毒不是H5或H7亚型，则应进行下列试验2将病毒接种于细胞培养物上，观察其在腕蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。2. 4. 2. 4. 3 对低致病性的所有H5或H7毒株和其他病毒，在缺乏膜蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关的肤链的氨基
10、酸序列分析，如果分析结果同其他高致病性流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。3 血凝(HA)和血摄抑制(HI)试验技术3. 1 材料准备3. 1. 1 96孔V型微量反应板，微量移液器(配有滴头。3. 1. 2 阿氏(Alsevers)液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。3.1.3 pH7.2、0.01mol/L PBSo 3. 1. 4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。3. 2 操作方法3. 2. 1 血凝(HA)试验(微量法)3. 2. 1. 1 在微量反应板的1孔12孔均加入0.025mL PBS，换滴头。3. 2. 1. 2 吸取0.
11、025mL病毒悬液(如感染性鸡胚尿囊液)加入第1孔，混匀。3.2.1.3 从第1孔吸取0.025mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第1孔吸取0.025时，弃之，换滴头。3. 2 1. 4 每孔再加入0.025mL PBSo 3. 2. 1. 5 每孔均加入0.025mL体积分数为1%鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)见附录B。256 GB/T 18936-2003 3.2.1.6 振荡混匀，在室温(20C-25C)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4C环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。3. 2. 1.
12、 7 结果判定z将板倾斜，观察红细胞有元呈泪满状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。3.2.2 血凝抑制(HI)试验(微量法)3. 2. 2. 1 根据3.2. 1试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1: 256，贝o4HAU抗原的稀释倍数应是1 64(256除以4)。3.2.2.2 在微量反应板的1孔-11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS. 3. 2. 2. 3 吸取0.025mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.
13、025mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025mL弃去.3.2.2.4 1孔-11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025mL，室温约20C)静置至少30min。3.2.2.5 每孔加入0.025mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min(室温约20(; ，若环境温度太高可置4C条件下进行)，对照红细胞将呈显钮拍状沉于孔底。3. 3 结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2 ，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3Og2判定HI试验阴性;HI价等于4log
14、，为可疑，需重复试验IHI价大于或等于5 log2为阳性。4 琼脂援胶免瘦扩散(AGID)试验4 1 材料准备4. 1. 1 硫柳乘溶液、pH7.2、0.01mol/L PBS溶液，配制方法见附录C.4. 1. 2 琼脂板z制备方法见附录D.4. 1. 3 禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清.4.2 据作方法4. 2. 1 打孔s在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔(中间l孔，周围6孔)，孔径约5mm.孔距2 mm.-.5 mm.将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底.4.2.2 封底:用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚目。要
15、溶化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。4.2.3 加样z用微量移液器或带有6-7号针头的0.25mL注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔(图l的号)，标准阳性血清分别加入外周的和孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔(图1的，号孔)。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。 。一.JI 图1AGP试翰结果4.2.4 作用g加样完毕后，静止5min ,._. lO min，然后将平皿轻轻倒置放人湿盒内，37C温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。257 GB/T 18936-2003 4. 3 结果判定4. 3. 1 判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血
16、清(图1的和号孔与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。4. 3. 2 判定标准4.3.2.1 若被检血清(如图l中的号)孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，贝tl被检血清判为阳性。4.3.2.2 被检血清(如图1中的号)与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清(如图1中)的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性(凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者，判为阳性)。4. 3. 2. 3 若被检血清(如图1中的号孔)孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。4.3.2.4
17、被检血清孔(图1中的号孔)与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异反应则判为阴性。5 间接酶联免瘦吸附试验(闰接ELISA)5. 1 材料准备5. 1. 1 酶标板、加样品(带滴头).酶标测定仪.5. 1. 2 使用溶液的配制=方法见附录E.5. 1. 3 间接ELISA抗原，间接ELISA酶标抗体。5. 1. 4 抗原包被板制备2方法见附录F.5.2 撮作步骤5. 2. 1 样品准备2将被检血清用稀释液(见附录E.5)做1 400稀释.5.2.2 加样2取出抗原包被板，倒掉孔内包被液，用洗液洗3次。除A1、B1
18、、C1和Dl孔不加样品，留做空白调零，阴性血清和阳性血清做对照各占1孔外，其余孔加1 400稀释的被检血清，每孔100L，将加样位置做好记录，将反应板盖好盖子后置37C环境下作用30min. 5.2.3 洗涤倒掉孔内液体，在吸水纸上空干，每孔加满洗液，静置1min-2 rnin后倒掉，空干，再重复洗2次。5.2.4 加酶标抗体z除Al、Bl、C1和Dl孔外，其他每孔加酶标抗体液100L.盖好盖子后置37C环境下作用30mno 5.2.5 洗涤z洗涤方法向5.2. 3. 5.2.6 加底物，:1m底物使用液(见附录E.的，每孔90L，置室温避光显色2min.3 min . 5.2.7 终止:加中
19、止液(见附录E.的，每孔90L，使其终止反应。5. 3 结果判定用酶标仪测定每个孔在490nm波长的光密度值(即00值).00二三0.2者判为阳性，0.18001. 2，因此，本试验中的分离株为HPAIVo259 GB/T 18936-2003 B. 1 阿氏(AJsevers)液配制葡萄糖拧棱酸纳拧擦酸附录B(规范性附录)HA和HI试验用藩液的配制2.05 g 0.8 g O. 055 g 氯化俐。.42g 如I蒸馆水至100mL.散热溶解后调pH值至6.1.69kPa 15 min高压灭菌.4C保存备用。B.2 1%鸡红细胞悬液制备采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的
20、血液与等体积阿氏液混合，用pH7.2、O.01 mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1000 r/min离心10mn，洗涤后用PBS配成体积分数为1%红细胞悬液.4C保存备用。260 GB/T 18936-2003 附录C(规范性附录)AGP试验用溶麓的配制C. 1 1 %硫柳柔溶液的配制硫柳录加蒸倒水至1. 0g 100 mL 溶解后，置100mL瓶中盖塞存放备用。C. 2 pH 7. 2、0.01mOI/L PBS的配和la)自己制25X PB，称量2.74g磷酸氢二销和0.79g磷酸二氢纳加蒸馆水至100mL, b)配制1X PBS，量取40时_25X PB.加入8.5g氯化锅，加蒸馆
21、水至1000 mL, c)用氢氧化纳或盐酸调pH至7.2，dl j(菌或过滤。c) IHS-经使用，于4C保存不超过3周。261 GB/T 18936-2003 附录D(规范性附录)琼脂板的制备称量琼脂糖1.0 g，加入100mL的pH7. 2、0.01mol/L PBS液中在水浴中煮沸充分融化，加入8g氯化纳，充分溶解后加人1%硫柳乘溶液1mL，冷至15C50C时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18mL20 mL，jm盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用(时间不超过2周)。262 GB/T 18936-2003 附录E(规范性附录)高致病性禽流
22、.间接ELISA使用溶渡的配制E. l 碳酸盐缓冲液(0.05mol/L、pH9.6，CBS1碳酸纳1. 59 g 碳酸氢纳2.93 g 用双蒸水溶解至1000 mL，于4C保存，不超过1个月。E. 2 磷酸盐缓冲液(0.01mol/L、pH7.4.PBS1氯化纳磷酸二氢销磷酸氢二饷(Na2HP. 12日，0)氯化梆加蒸馆水至8 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 1 000 mL E. 3 洗液(含o05 % Tween-20的0.01mol/L、pH7.4的PB函，即PBSTJTween-20 加0.01mol/L , pH7. 4的PBS至E. 4 封闭液(含0.5%BSA纳PB晴T
23、1牛血清白蛋白(BSA1加洗液至4 C存放，避光。E. 5 稀辑液(含O.1 %BSA的PBST1牛血清白蛋白(BSA1加洗液至4 C存放，避光。0.5 mL 1000 mL 0.5 g 100 mL O. 1 g 100 mL E. 6 间接ELISA底物缓冲菠(确隘氯二锅-拧搬回量.pH5.4)0.2 mol/L磷酸氢二纳CNa，HP. 12H,O) O. 1 mol/L拧橡酸双蒸水26.7 mL 24.3 mL 49 mL 准确称量40mg邻苯二胶(OPDl.溶解后置暗处保存，临用前加入30%过氧化氢150L。用时现配，避光。E. 7 三握甲基氨基甲婉-盐隘(Tris-HCD缓冲液(0.
24、05mol/L pH7. 61 O. 1 mol/L Tris O. 1 mol/L盐酸双蒸水250 mL 192.5 mL 57.5 mL 263 GB/T 18936-2003 E. 8 间接ELISA终止液浓硫酸蒸馆水264 11. 1 mL 88.9 mL GB/T 18936-2003 附录F(规范性附录)高致病性禽流感间接ELISA抗原包被板制备抗原包被板也称诊断板，将高致病性禽流感抗原用0.05mol/L. pH9. 6碳酸盐缓冲液(见附录第E. 1章)稀释成3g/mL全病毒抗原)或6g/mLC重组核蛋白抗原).包被40孔聚苯乙烯微量板，每孔100L.置4C冰箱过夜，用洗液洗涤(见附录第E.3章)3次，用封闭液(见附录第E.4章)于3TC湿盒内封闭60min，用洗涤液洗涤3次，干燥后即为诊断板，置4C冰箱备用。265
